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第一部分间充质干细胞旁分泌肝细胞生长因子通过激活mTOR/STAT3信号通路改善肺微血管内皮细胞损伤的机制研究目的研究间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)旁分泌肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)对脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的肺微血管内皮细胞(Pulmonary microvascular endothelial cell,PMVEC)损伤的保护机制。方法采用Transwell小室构建MSC和PMVEC共培养体系,培养4-72h。PMVEC内加入LPS(100ng/ml)构建LPS诱导的内皮细胞损伤。给予外源性重组小鼠HGF(20ng/ml),同时加入哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂雷帕霉素(100nmol/L)或STAT3抑制剂(Signal transducer and activator of transcription 3,S3I-201)(100nmol/L)检测mTOR/STAT3信号通路在HGF对LPS诱导的PMVEC损伤中的作用。检测以下指标:(1)内皮细胞通透性:分别采用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)-葡聚糖法和FITC-白蛋白法检测内皮细胞旁及跨内皮细胞通透性系数;(2)PMVEC上清液中ET-1和vWF浓度:采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法;(3)内皮细胞连接蛋白表达:采用免疫荧光法检测内皮细胞连接蛋白Occludin表达;(4)内皮细胞增殖及凋亡检测:分别采用Cell Counting Kit-8(CCK8)法和流式Annexin V-FITC/PI法检测内皮细胞增殖及凋亡;(5)相关信号通路检测:采用蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)检测p-Akt(Ser473)、Akt、p-mTOR(Ser2448)、mTOR、p-p70S6 Kinase(Thr389)、p70S6 Kinase、p-STAT3(Ser727)、STAT3蛋白表达。结果(1)LPS损伤的肺微血管内皮细胞的建立:细胞旁通透性试验显示100ng/ml LPS较对照组明显增加PMVECs细胞旁通透性,且与LPS浓度呈正比(P<0.05);100ng/ml LPS作用于PMVECs后内皮损伤标志物ET-1及vWF分泌较对照组增多(P<0.05),呈时间依赖性(4h-24h-72h依次升高)。(2)MSC旁分泌HGF激活mTOR/STAT3信号通路对ARDS内皮屏障的影响:免疫荧光结果显示,与LPS组相比,MSC-PMVEC共培养组及外源性重组HGF组(20ng/ml)能增加Occludin表达。内皮细胞旁和跨细胞通透性试验显示,与LPS组相比,HGF组明显减轻PMVECs细胞旁及跨细胞通透性,且呈时间依赖性(P<0.05)。同时外源性给予20ng/ml HGF较LPS组减少内皮损伤标志物ET-1及vWF的产生,且呈时间依赖性(P<0.05)。WB显示,20ng/ml HGF较LPS组增加p-mTOR(Ser2448)及p-STAT3(Ser727)磷酸化水平。(3)mTOR信号通路在HGF修复PMVEC中的作用:免疫荧光结果显示,LPS刺激PMVEC后导致Occludin的表达减少,HGF可以增加Occludin的表达,mTOR抑制剂雷帕霉素逆转HGF的保护作用。内皮细胞旁和跨细胞通透性试验显示,HGF可以降低LPS损伤的PMVECs细胞旁及跨细胞通透性,这种保护性降低通透性作用被mTOR抑制剂雷帕霉素逆转并升高(P<0.05)。ELISA试验显示,外源性给予HGF减少LPS刺激造成的内皮损伤标志物ET-1及vWF的产生,给予雷帕霉素后,内皮损伤标志物ET-1及vWF产生增多(P<0.05)。WB信号通路检测显示,HGF较LPS组增加p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)、p-p70S6Kinase(Thr389)及p-STAT3(Ser727)磷酸化水平;给予mTOR抑制剂雷帕霉素后,蛋白磷酸化水平降低。(4)STAT3信号通路在HGF修复PMVEC中的作用:免疫荧光结果显示,LPS刺激PMVEC后导致Occludin表达减少,HGF可以增加Occludin的表达,STAT3抑制剂S3I-201逆转HGF的保护作用。内皮细胞旁和跨细胞通透性试验显示,HGF可以降低LPS损伤的PMVECs细胞旁及跨细胞通透性,这种保护性降低通透性作用被STAT3抑制剂S3I-201逆转并升高(P<0.05)。ELISA试验显示,与LPS组相比,外源性给予HGF造成内皮损伤标志物ET-1及vWF减少,给予S3I-201后,内皮损伤标志物ET-1及vWF产生增多(P<0.05)。WB信号通路检测显示,HGF较LPS组增加p-STAT3(Ser727)磷酸化水平;给予STAT3抑制剂S3I-201后,蛋白磷酸化水平降低。(5)mTOR/STAT3信号通路在HGF减轻PMVEC凋亡中的作用:LPS抑制PMVECs增殖活力,外源性重组HGF可以减轻LPS损伤的内皮细胞增殖活力(P<0.05);然而给予mTOR抑制剂雷帕霉素和STAT3抑制剂S3I-201阻断后,增殖作用被明显抑制(P<0.05)。应用Annexin V-FITC法检测内皮细胞凋亡,结果显示,LPS明显增加PMVECs凋亡,HGF可以减轻LPS诱导的内皮细胞凋亡(P<0.05);给予mTOR抑制剂雷帕霉素和STAT3抑制剂S3I-201阻断后,HGF的抗凋亡的作用明显被抑制(P<0.05)。结论(1)MSC旁分泌HGF降低肺微血管内皮细胞旁和跨血管内皮细胞通透性,增加内皮细胞间接蛋白Occludin的表达,减少内皮细胞损伤标志物ET-1及vWF的表达,促进内皮细胞增殖,减少内皮细胞凋亡。(2)MSC旁分泌HGF通过激活mTOR/STAT3信号通路促进LPS损伤的肺微血管内皮细胞的修复。第二部分mTORC1及mTORC2信号通路在MSC旁分泌HGF改善肺微血管内皮细胞损伤中的作用目的研究mTORC1及mTORC2信号通路在MSC旁分泌HGF改善LPS诱导的PMVEC损伤中的作用。方法采用Transwell小室构建MSC和PMVEC共培养体系,培养4-72h。PMVEC内加入脂多糖(LPS,100ng/ml)构建LPS诱导的损伤内皮细胞,PMVEC中加入外源性重组小鼠HGF(20ng/ml),并构建基因干扰慢病毒介导的低表达mTORC1(Raptor)及mTORC2(Rictor)的PMVEC(PMVEC-shRaptor、PMVEC-shRictor),检测mTORC1及mTORC2信号通路在MSC旁分泌HGF改善PMVEC损伤中的作用。同时给予Akt AZD5363(1μM)检测Akt的作用。检测以下指标:(1)内皮细胞通透性:分别采用FITC-葡聚糖法和FITC-白蛋白法检测PMVECs细胞旁及跨内皮细胞通透性系数;(2)内皮细胞连接蛋白表达:采用流式检测内皮细胞连接蛋白VE-cadherin表达;(3)内皮细胞凋亡及增殖检测:分别采用Annexin V-PE/7-AAD法和CCK8法检测内皮细胞凋亡及增殖;(4)相关信号通路检测:采用Western blot检测p-Akt(Ser473)、Akt、Raptor、Rictor、p-mTOR(Ser2448)、mTOR蛋白表达。结果(1)MSC旁分泌HGF对内皮细胞粘附连接蛋白VE-cadherin的影响:流式结果显示,与对照组比较,MSC-PMVEC共培养组及重组HGF组可以提高PMVECs的VE-cadherin表达(P<0.05);在信号通路的相关研究中,随着重组HGF作用时间的延长(4h-24h),mTOR、mTORC1(raptor)、mTORC2(rictor)表达逐渐增多,呈时间依赖性。(2)慢病毒介导的mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)低表达的PMVECs鉴定:采用基因干扰慢病毒介导,分别构建mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)低表达的PMVECs细胞株,荧光显微镜检测转染效率显示,细胞表达良好的绿色荧光信号。与干扰对照组PMVEC-GFP比较,PCR结果显示PMVEC-ShRaptor、PMVEC-ShRictor的Raptor mRNA和Rictor mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。WB结果显示PMVEC-ShRaptor、PMVEC-ShRictor的Raptor蛋白和Rictor蛋白表达降低。(3)mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)对内皮细胞粘附连接蛋白VE-cadherin的影响:流式结果显示,与LPS组相比,给予外源性HGF后,内皮细胞粘附连接蛋白VE-cadherin的表达水平增高;分别给予shRaptor及shRictor下调PMVECs中raptor及rictor表达后,VE-cadherin的表达水平明显减少(P<0.05)。(4)mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)对内皮细胞屏障的影响:流式细胞学分析显示,在给予重组HGF作用下,PMVEC-shRaptor及PMVEC-shRictor组分别较PMVEC-shRaptor-control及PMVEC-shRictor-control组相比,内皮的细胞旁及跨细胞通透性升高(P<0.05)。WB结果显示,HGF可以提高LPS损伤的raptor及磷酸化的p-p70S6K(Thr389)蛋白,同时也提高LPS损伤的rictor及磷酸化的p-AKT(Ser473)蛋白表达;分别基因沉默mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)后,raptor、rictor及磷酸化的p-p70S6K(Thr389)、p-AKT(Ser473)蛋白水平降低。(5)mTORC2/Akt对内皮细胞屏障的影响:流式细胞学结果显示,阻断Rictor后,HGF刺激的VE-cadherin的减少,继续给予Akt的抑制剂AZD5363(1μM)后,VE-cadherin的表达减少(P<0.05)。细胞通透性试验显示,与LPS+HGF共刺激组相比,shRictor(+)可以上调内皮细胞旁及跨内皮细胞通透性(P<0.05),Akt的抑制剂AZD5363可以继续上调内皮细胞旁及跨内皮细胞通透性(P<0.05)。(6)mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)对内皮细胞凋亡的影响:细胞凋亡和增殖试验显示:外源性重组HGF可以减轻LPS损伤的内皮细胞凋亡、促进内皮细胞增殖(P<0.05);然而,基因沉默shRaptor及shRictor后,内皮细胞增殖作用被明显抑制、凋亡增加(P<0.05)。凋亡蛋白Caspase-3的WB试验显示,与LPS+HGF共刺激组相比,基因沉默shRaptor及shRictor可以增加凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3的表达。结论(1)mTORC1及mTORC2信号通路的激活参与MSC旁分泌HGF修复LPS诱导的PMVEC损伤。(2)mTORC2/Akt参与MSC旁分泌HGF修复LPS诱导的PMVEC损伤。第三部分mTOR/STAT3信号通路在HGF减轻LPS诱导的肺微血管内皮细胞线粒体依赖性凋亡中的作用目的研究mTOR/STAT3信号通路在HGF减轻LPS诱导的PMVEC线粒体依赖性凋亡中的作用。方法PMVEC内加入脂多糖(LPS,100ng/ml)构建LPS诱导的损伤内皮细胞,PMVEC中加入外源性重组小鼠HGF(20ng/ml),同时加入mTOR抑制剂雷帕霉素(100nmol/L)或S3I-201抑制剂(100nm/L)检测mTOR/STAT3信号通路在HGF减轻LPS损伤的PMVEC线粒体依赖性凋亡中的作用。检测以下指标:(1)细胞内钙离子浓度检测:流式检测细胞内Fluo-4荧光变化;(2)活性氧(ROS)检测:流式DCFH-DA法检测ROS水平;(3)呼吸链复合物I(Complex I)表达:采用WB法检测Complex I核心蛋白NDUFB8表达。(4)细胞凋亡及增殖检测:分别采用Annexin V-FITC/PI法和CCK8法检测内皮细胞凋亡及增殖。(5)凋亡蛋白Caspase3蛋白检测:Western blot法。(6)抗凋亡基因Bcl-2及Bcl-XL mRNA检测:逆转录-实时荧光定量聚合酶链式反应(Reverse transcription Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)。(7)内皮连接蛋白VE-Cadherin和ZO-1检测:Western blot法。结果(1)mTOR/STAT3信号通路在HGF对内皮细胞内钙离子浓度的影响:Fluo-4荧光检测试验显示,与control相比,LPS刺激使内皮细胞内钙离子内流增加,HGF可以减少钙内流,给予mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201后,钙内流增加(P<0.05)。(2)mTOR/STAT3信号通路在HGF对内皮细胞ROS的影响:流式DCFH-DA检测表明,随着HGF作用时间延长(30-60-90-120min),ROS的产生减少(P<0.05)。同时,在30min的药物作用时间下,HGF可以减少LPS刺激产生的ROS产生;然而加入mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201后,ROS产生增多(P<0.05)。(3)mTOR/STAT3信号通路在HGF对Complex I的影响:WB结果显示,LPS可以造成Complex I(NDUFB8)损伤,HGF可以减少LPS造成的Complex I(NDUFB8)损伤;给予mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201后,Complex I(NDUFB8)的表达减少(P<0.05)。(4)HGF对LPS诱导的PMVEC凋亡及增殖的影响:流式Annexin V-PE/7-AAD凋亡试验检测,随着HGF作用时间的延长(1h,2h,4h),早期细胞凋亡比率降低;内皮细胞增殖试验显示,LPS可以降低内皮细胞吸光度(optical density,OD)值,给予HGF作用4h-12h-24h后,内皮细胞OD值增加(P<0.05)。(5)mTOR/STAT3信号通路在内皮细胞凋亡蛋白中的影响:WB结果显示,LPS可以促进凋亡相关蛋白活性cleaved-caspase-3的增加,给予HGF可以减少cleaved-caspase-3的表达。mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201可以抑制凋亡蛋白的cleaved-caspase-3的表达(P<0.05)。(6)HGF对抗凋亡基因Bcl-2mRNA及Bcl-XL mRNA的影响:RT-qPCR检测发现,与LPS组相比,HGF增加抗凋亡基因Bcl-2 mRNA、Bcl-XLmRNA的表达,并且mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201可以抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA、Bcl-XL mRNA的表达(P<0.05)。基因沉默mTORC1(raptor)及mTORC2(rictor)后,可抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA及Bcl-XL mRNA的表达(P<0.05)。(7)HGF对内皮细胞连接蛋白VE-cadherin及Occludin的影响:WB结果显示,HGF可以增加损伤的内皮细胞连接蛋白VE-cadherin及Occludin;然而,给予mTOR抑制剂雷帕霉素及STAT3抑制剂S3I-201后,VE-cadherin及Occludin的表达水平减少。结论mTOR/STAT3信号通路激活参与HGF减轻LPS诱导的PMVEC线粒体依赖性凋亡。