陕西省太白尾矿废弃地重金属抗性根瘤菌的特性及其遗传多样性研究

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从陕西太白金矿尾矿废弃地收集广布野豌豆、天蓝苜蓿、歪头菜、截叶铁扫帚、马棘、金翼黄芪、杭子梢、葛藤等7个属8种豆科植物根瘤,分离纯化得到108株根瘤菌,从中筛选具有重金属抗性的优良根瘤菌菌株,并对其中55株根瘤菌进行遗传多样性及系统发育地位研究。本论文是国内首次对西北干旱半干旱地区矿区根瘤菌遗传多样性及其重金属抗性特性的研究。通过重金属抗性筛选实验,筛选得到一株抗性优良、生长势较好的根瘤菌菌株RS33-2,并进行该菌在不同pH培养条件下的生长曲线测定、不同重金属元素不同浓度的菌体生长抑制实验、菌体对重金属离子吸附量、抗性基因扩增和生理生化特性、系统发育地位等方面的研究。不同pH培养条件下的生长曲线表明:随着pH降低,菌体生长量降低,pH介于6.5-7.0时菌体的生长势最好。不同重金属元素不同浓度的菌体生长抑制结果显示:四种重金属对菌体生长抑制能力顺序为:Cd2+>Cu2+>Pb2+>Zn2+,随着重金属离子浓度的升高,菌体生长量随之降低,在高浓度重金属离子下菌体在开始生长阶段呈现负增长现象。菌体对不同重金属元素离子的吸附表明:RS33-2对重金属的吸附量大小顺序为:Zn2+>Cd2+>Pb2+>Cu2+,细胞内对重金属的吸附比细胞壁的吸附大,菌体对重金属最大吸附量随元素种类,处理时间的不同而不同。扩增重金属抗性基因的部分序列结果表明RS33-2菌株存在抗铜的基因cop A,测序并进行比对发现其相似性与Caulobacter crescentus CB15(NP419780)最高,为69.6%;系统发育地位研究表明RS33-2与土壤杆菌属Agrobacterium的亲缘关系较近,相似性为98.894.4%,其中与Ag. tumefaciens LMG196相似性最高,为98.8%。对寄主植物分别为天蓝苜蓿、歪头菜、截叶铁扫帚、广布野豌豆、葛藤、杭子梢的55株根瘤菌进行16S rDNA PCR-RFLP、23S rDNA PCR-RFLP、IGS PCR-RFLP的遗传多样性分析及16S rDNA全序列系统发育地位研究。16S rDNA PCR-RFLP结果显示所有菌株在70%的相似性水平聚到一起,根据寄主植物关系将所有菌株分成3个遗传群。23S rDNA PCR-RFLP结果显示所有菌株在74%相似性水平上聚到一起,IGS PCR-RFLP分析表明所有菌株在66%相似性水平聚到一起。16S rDNA PCR-RFLP与23S rDNA PCR-RFLP结果具有较好的一致性。PCR-RFLP分析结果显示:分离自天蓝苜蓿的根瘤菌遗传差异性较少,分离自截叶铁扫帚的根瘤菌表现出丰富的遗传多样性。在16S rDNA PCR-RFLP分析结果的基础上,选取有代表性的菌株进行16S rDNA全序列测定。系统发育地位分析结果显示:分离自天蓝苜蓿的根瘤菌TB50-1和TB99-2属于中华根瘤菌Sinorhizobium属,与S. melilotiLMG6133的关系较近,相似性最高,分别为99.8%和99.4%;分离自截叶铁扫帚的根瘤菌处于两个系统发育分支:土壤杆菌属Agrobacterium和根瘤菌属Rhizobium,其中TB17-1与R. leguminosarum USDA2370相似性最高,为98.8%,RS33-2与Ag. tumefaciens LMG196相似性最高,为98.8%;分离自杭子梢的根瘤菌TB94-1属于根瘤菌属Rhizobium,其中与R. gallicum R602相似性最高,为99.4%。
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