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目的:中国是世界上糖尿病患病人数最多的国家。最新数据显示我国20～79岁的糖尿病人口已达1.14亿。47%～64%的糖尿病患者会发生原发性角膜病变,临床表现为角膜上皮愈合延迟、角膜知觉减退、神经营养性角膜溃疡等。糖尿病患者伤口迁延不愈一直是临床棘手的治疗难题,而白内障和眼底手术都会给糖尿病患者带来角膜损伤的机会。中性粒细胞是在伤口愈合早期起主要作用的炎症细胞。它在糖尿病个体损伤后浸润延迟,且发生被称为NETosis的细胞死亡,释出细胞核内的组蛋白和DNA至细胞外,形成中性粒细胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs),捕获细菌抵抗感染的同时造成组织损伤。PAD4酶是催化NETosis的关键酶,细胞外DNA(extracellular DNA,e DNA)和组蛋白是NETs的关键组分,在宿主中诱导强烈的免疫反应,导致组织损伤。靶向NETs治疗可以显著促进糖尿病皮肤愈合。清除e DNA的DNase Ⅰ和抑制NETs形成的PAD4抑制剂是两种最主要的靶向NETs的治疗方式。但目前尚无研究涉及NETs在糖尿病角膜上皮再生过程中的作用及机制,NETs与神经再生的关系更是当前研究的空白。本研究首先观察比较了DNase Ⅰ和PAD4抑制剂促进糖尿病小鼠角膜上皮和神经再生的作用,并对NETs在糖尿病角膜上皮和角膜神经再生过程中的作用机制进行了探讨。方法:1.抗NETs治疗角膜上皮损伤的效果观察及DNase Ⅰ促进糖尿病小鼠角膜上皮再生的机制研究选择C57BL/6J雄性小鼠,使用STZ(链脲佐菌素)小剂量多次腹腔注射诱导的1型糖尿病小鼠模型,并在此基础上建立角膜上皮机械损伤模型。通过预实验确定抗NETs治疗(DNase Ⅰ和PAD4抑制剂)治疗1型糖尿病小鼠角膜上皮损伤的给药方法。通过小鼠角膜荧光素钠染色法观察抗NETs治疗(DNase Ⅰ点眼和腹腔注射PAD4抑制剂)对正常和糖尿病小鼠角膜上皮再生的影响。通过免疫荧光和Western Blot检测1mg/ml的DNase Ⅰ点眼对糖尿病小鼠角膜上皮再生相关信号通路(pAkt、IGF-1R和Sirt1)、角膜上皮氧化应激相关信号通路(ROS、NOX2和NOX4)、角膜缺氧诱导因子HIF-1α表达水平的影响。2.DNase Ⅰ对糖尿病小鼠角膜上皮再生过程中炎症反应的影响通过免疫荧光和Western Blot检测正常和糖尿病小鼠角膜上皮损伤后不同时间点的NETs标志物H3Cit和中性粒细胞标志物Ly6G的表达部位及表达水平。通过免疫荧光和Western Blot检测DNase Ⅰ治疗对糖尿病小鼠损伤的角膜中H3Cit和Ly6G表达水平的影响。通过Elisa检测DNase Ⅰ治疗对糖尿病小鼠损伤的角膜中NETs标志物:NE(中性粒细胞弹性蛋白酶)和MPO(髓过氧化物酶)表达水平的影响。通过免疫荧光和Western Blot检测DNase Ⅰ对糖尿病小鼠损伤的角膜中巨噬细胞标记物F4/80和M2型巨噬细胞标记物CD206表达的影响。通过q PCR检测DNase Ⅰ对糖尿病小鼠损伤的角膜中与巨噬细胞分型相关的mRNA表达水平的影响。3.DNase Ⅰ对糖尿病小鼠角膜神经再生的影响通过角膜神经染色和角膜敏感度测量观察比较DNase Ⅰ对糖尿病小鼠角膜神经纤维再生的影响。结果:1.抗NETs治疗促进正常和糖尿病小鼠的角膜上皮再生1mg/ml的DNase Ⅰ点眼可促进正常小鼠角膜上皮再生(P<0.01),并促进糖尿病小鼠角膜上皮再生(P<0.01),且在24h时即表现出治疗效果。全身应用Cl-amidine(PAD4抑制剂,10mg/kg,腹腔注射)在24h时对糖尿病小鼠角膜上皮再生无明显影响(P>0.05),但在48h时表现出促进糖尿病小鼠角膜上皮再生的作用(P<0.01)。DNase Ⅰ促进糖尿病小鼠角膜上皮再生的机制有:(1)DNase Ⅰ活化糖尿病小鼠角膜上皮再生相关信号通路pAkt、IGF-1R和Sirt1主要表达于小鼠的角膜上皮层。角膜上皮损伤后48h时,糖尿病小鼠角膜中pAkt、IGF-1R和Sirt1的表达量低于正常小鼠(P<0.01),DNase Ⅰ治疗增加了pAkt、IGF-1R和Sirt1在糖尿病小鼠角膜中的表达水平(P<0.01)。(2)DNase Ⅰ抑制糖尿病小鼠角膜氧化应激相关信号通路ROS主要表达于小鼠的角膜上皮层。糖尿病小鼠ROS的免疫荧光强度高于正常小鼠(P<0.01),DNase Ⅰ治疗可减少糖尿病小鼠角膜上皮层ROS的表达水平(P<0.01)。NOX2和NOX4主要表达于小鼠角膜上皮层。糖尿病小鼠角膜中NOX2和NOX4的蛋白表达水平高于正常小鼠(P<0.01),DNase Ⅰ治疗可减少糖尿病小鼠角膜中NOX2和NOX4的表达水平(P<0.05)。(3)DNase Ⅰ调节糖尿病小鼠角膜中HIF-1α的表达HIF-1α的表达主要位于小鼠的角膜上皮层。糖尿病小鼠角膜中HIF-1α的蛋白表达水平高于正常小鼠(P<0.01),DNase Ⅰ治疗可减少糖尿病小鼠角膜中HIF-1α的表达水平(P<0.01)。在角膜上皮损伤后48h,糖尿病小鼠角膜中HIF-1α的表达水平低于正常小鼠(P<0.01),DNase Ⅰ治疗可增加角膜上皮再生过程中糖尿病小鼠角膜中HIF-1α的表达水平(P<0.01)。2.DNase Ⅰ抑制糖尿病小鼠角膜的炎症反应(1)糖尿病小鼠角膜上皮损伤后中性粒细胞浸润和NETs形成增加刮除角膜上皮后24h时,正常小鼠的中性粒细胞标志物Ly6G出现在角膜基质浅层;48h时,Ly6G的表达减少。NETs标志物H3Cit的表达始终位于中性粒细胞浸润处的角膜基质中,且24h时的免疫荧光强度高于48h。刮除角膜上皮后24h时,糖尿病小鼠角膜中Ly6G的免疫荧光强度弱于正常小鼠;48h时显著增多,免疫荧光强度强于正常小鼠。H3Cit的表达始终位于中性粒细胞浸润处的角膜基质中,且48h时的免疫荧光强度高于24h。正常小鼠在角膜上皮损伤后所有时间点,角膜中H3Cit/H3的表达水平没有显著变化(P>0.05);糖尿病小鼠在刮除角膜上皮后48h时角膜中H3Cit/H3的表达水平升高,且高于正常小鼠(P<0.01)。(2)DNase Ⅰ抑制糖尿病小鼠角膜上皮再生过程中中性粒细胞的炎症反应角膜上皮刮除后48h时,糖尿病小鼠角膜中H3Cit/H3和Ly6G的表达水平均较正常小鼠增高(P<0.01);经DNase Ⅰ治疗后,H3Cit/H3和Ly6G的表达下降至正常小鼠水平(P>0.05)。Elisa检测结果显示糖尿病小鼠角膜中MPO和NE的表达水平高于正常小鼠(P<0.01);经DNase Ⅰ治疗后,糖尿病小鼠角膜中MPO和NE的表达均较糖尿病小鼠下降(P<0.05)。(3)DNase Ⅰ抑制糖尿病小鼠角膜上皮再生过程中巨噬细胞的炎症反应角膜上皮损伤后48h时,糖尿病小鼠角膜中巨噬细胞表面标志物F4/80的免疫荧光强度高于正常小鼠;经DNase Ⅰ治疗后,不仅角膜基质中F4/80的免疫荧光强度明显降低,而且M2型巨噬细胞表面标志物CD206的免疫荧光强度也有所增强。q PCR结果显示:糖尿病小鼠角膜中与M1型巨噬细胞相关的i NOS、CD86、TNF-α、MCP-1、IL-12的mRNA表达水平高于正常小鼠(P<0.001),与M2型巨噬细胞相关的IL-10、Arg-1、CD206的mRNA表达水平低于正常小鼠(P<0.01);经DNase Ⅰ治疗后,糖尿病小鼠角膜中与M1型巨噬细胞相关的mRNA表达水平下降(P<0.05),与M2型巨噬细胞相关的mRNA表达水平升高(P<0.01)。3.DNase Ⅰ促进糖尿病小鼠角膜神经再生(1)DNase Ⅰ促进糖尿病小鼠角膜上皮下神经丛的神经纤维再生角膜上皮损伤后第21天,在角膜中央区,正常小鼠、糖尿病小鼠和DNase Ⅰ治疗的糖尿病小鼠角膜上皮下神经丛神经纤维密度依次为18.3±2.7%、5.3±1.9%、8.7±3.7%;其中糖尿病小鼠的神经纤维密度低于正常小鼠(P<0.001),经DNase Ⅰ治疗后增加(P<0.05)。在角膜周边区,正常小鼠、糖尿病小鼠和DNase Ⅰ治疗的糖尿病小鼠角膜上皮下神经丛神经纤维密度依次为14.6±2.7%、5.0±2.1%、8.0±2.8%;其中糖尿病小鼠的神经纤维密度低于正常小鼠(P<0.05),经DNase Ⅰ治疗后增加(P<0.05)。(2)DNase Ⅰ促进糖尿病小鼠角膜敏感度恢复刮除角膜上皮后,小鼠的角膜敏感度显著下降。在角膜上皮损伤后的第7天,正常小鼠的角膜敏感度恢复到接近受伤前的水平。糖尿病小鼠的角膜敏感度恢复缓慢。在角膜上皮损伤后的第3、7、14、21天,糖尿病小鼠的角膜敏感度均低于正常小鼠(P<0.01),DNase Ⅰ治疗后升高(P<0.05),且从第3天开始就使糖尿病小鼠的角膜敏感度恢复到接近正常小鼠的恢复水平(P>0.05)。结论:1.抗NETs治疗可同时促进正常小鼠和糖尿病小鼠的角膜上皮再生,清除e DNA的DNase Ⅰ的治疗效果优于抑制NETs形成的PAD4抑制剂。DNase Ⅰ通过活化角膜上皮再生相关信号通路、抑制角膜氧化应激相关信号通路、调节HIF-1α活化水平,促进糖尿病小鼠角膜上皮再生。2.DNase Ⅰ通过抑制糖尿病小鼠角膜损伤后中性粒细胞和巨噬细胞引起的炎症反应,促进糖尿病小鼠角膜上皮再生,提示e DNA是糖尿病角膜损伤后过度炎症的重要原因。3.DNase Ⅰ可促进糖尿病小鼠角膜上皮下神经丛神经纤维再生,促进角膜敏感度的恢复,提示e DNA产生增多和清除延迟是延缓糖尿病角膜神经再生的重要原因。创新及意义:本研究首次证实了抗NETs治疗可以促进糖尿病角膜上皮和角膜神经再生,同时在对DNase Ⅰ和PAD4抑制剂的治疗效果进行比较后,发现清除e DNA的DNase Ⅰ治疗糖尿病角膜损伤的效果优于抑制NETs形成的PAD4抑制剂。本研究提供了DNase Ⅰ治疗糖尿病角膜损伤的作用机制不仅涉及抑制角膜炎症反应,还涉及活化角膜上皮再生相关信号通路、抑制角膜氧化应激反应相关信号通路、调节HIF-1α活性,同时首次报道了清除eDNA可以促进角膜神经纤维再生。由于DNase Ⅰ治疗糖尿病角膜损伤的作用涉及多方面机制,且经济易得,使其具有良好的临床应用前景。