在过去的几十年里,共振能量转移（Resonance energy transfer,RET）作为一种光谱技术被广泛应用于生物分子的结构鉴定及其相互作用,体外分析,体内分子监测,核酸检测分析,信号转导,光捕获等方面的研究。RET是指能量供体与受体在距离很近的情况下通过偶极-偶极作用发生非辐射能量转移的过程。在这一过程中能量供受体对的选择对提高能量转移效率是至关重要的。石墨烯量子点（Graphene quantum dots,GQDs）因制备简单、水溶性好、光致发光可调、光稳定性强和生物相容性好等特点成为很好的能量供体。近几年GQDs作为能量供体逐渐被应用于生化分析检测、生物成像以及疾病诊断等众多领域中。而GQDs修饰是能量转移体系构建的关键。目前,特异性较高的共价修饰方法要求GQDs表面带有大量羧基或氨基,因此,合成官能团丰富的GQDs对能量转移体系构建是十分重要的。目前,基于能量转移的荧光纳米探针已广泛用于疾病标志物miRNA的成像检测分析。传统的能量转移纳米探针多采用供体和受体1:1的方式,受能量转移效率的限制,在生物细胞成像过程中多出现背景信号高、假阳性信号等问题,从而影响检测的灵敏度和准确性。另外,细胞内低表达的miRNA对检测的灵敏度有着更高的要求,传统的一些扩增策略包括RT-PCR、滚环扩增法、恒温指数扩增法等解决了低丰度miRNA的检测,但是这些方法均需要DNA聚合酶或者内切酶的参与,从而降低了miRNA检测的重复性。为了解决这些问题,本论文合成光稳定性好、生物相容性高以及表面富含羧酸官能团的单层石墨烯量子点,通过荧光关开的形式将其应用于磷酸根的检测,并通过共价修饰的方式成功的将其用于能量转移体系构建,应用于miRNA的检测。此外,还构建了双重能量转移探针,实现miRNA低背景成像分析。最后,通过催化发卡自组装（Catalyzed hairpin assembly,CHA）循环结合X型DNA双信号放大的方法实现对miRNA高灵敏检测,具体工作如下:1.单层石墨烯量子点的合成及其用于磷酸根和miR-21的检测表面官能团对GQDs功能化起着至关重要的作用,因此合成表面官能团丰富的GQDs是十分有意义的。单层石墨烯量子点（single-layer graphene quantum dots,s-GQDs）结构简单,具有较大的表面积,对两面官能团功能化是有帮助的。我们采用现有的碳量子点（Carbon quantum dots,CQDs）作为底物,通过甲醇剥离的方法合成了绝对量子产率高达86.9%的s-GQDs。通过透射电子显微镜和高分辨率透射电子显微镜表征其形貌、粒径大小以及原子力显微镜表征其厚度。红外光谱、X射线光电子能谱表征其表面官能团,合成的s-GQDs的含氧量从CQDs的24.8%增加到47.5%。并通过稀土离子Dy³⁺诱导s-GQDs聚集荧光猝灭的方法证明其表面富含羧酸官能团,而磷酸根可竞争配位Dy³⁺使s-GQDs解聚进而荧光恢复,可通过这种荧光关开的方式检测磷酸根。另外,羧酸基团为s-GQDs的功能化提供了有利条件,通过共价修饰的方法使用DNA将s-GQDs功能化,s-GQDs作为供体,BHQ1作为受体,通过DNA连接构建能量转移体系,并借助CHA循环实现对miR-21的检测。2.双重能量转移荧光纳米探针用于非酒精性脂肪肝细胞中miR-21的低背景成像传统的能量转移大多是一个供体对应一个受体,由于受能量转移效率的限制,导致能量转移纳米探针在生物组织或细胞成像中存在较高的背景信号,并且降低了检测的灵敏度。为了解决这一问题,我们将黑洞猝灭剂（Back hole quencher 2,BHQ2）偶联到金纳米颗粒（Gold nanoparticle,AuNPs）表面上作为复合能量受体,量子点（Quantum dots,QDs）作为能量供体,通过金-硫键和生物素-链霉亲和素相互作用将复合受体和供体上分别修饰一条单链DNA,通过DNA碱基互补配对杂交方式将供受体对距离拉近,构建NSET联合FRET的双重能量转移荧光纳米探针,QDs在AuNPs和BHQ2双重猝灭下显示出更低的荧光背景,其荧光猝灭效率从56.5%增加到82.8%。当靶物miR-21出现时,打开双链DNA,供受体距离变远,QDs荧光恢复,并且QDs的荧光强度随着靶物miR-21浓度的增加而增强,靶物浓度在2.0 nM-15.0 nM范围呈现出很好的线性关系,检测限为0.22 nM（三倍标准偏差计算法,n=11）,相比于只有AuNPs为受体的单能量转移,双重能量转移的灵敏度提高了13.5倍。此外,该方法具有较好的选择性,能够区分仅有一个碱基错配的miRNA。因此该探针可应用于非酒精性脂肪肝细胞中miR-21的低背景成像分析。3.靶物激活催化X型DNA自组装循环反应用于miR-21的高灵敏检测miRNA在细胞内表达量极低,因此高灵敏地检测低丰度表达的miRNA是核酸检测的难点也是目标之一。我们借助CHA实现靶物循环以及利用X型DNA结构双信号放大策略进行靶物miR-21的检测。以四个末端均修饰有能量供体FAM、受体BHQ1的发夹结构DNA（Hairpin,H）为基本单元,当靶物miR-21不存在时FAM和BHQ1距离靠近发生能量转移,FAM的荧光被猝灭。当加入miR-21后,在靶物的诱发下先打开循环链H0,之后携带有靶物的H0打开第一个发卡H1,随后通过碱基互补配对竞争依次打开H2、H3、H4最后形成X型DNA结构,则在四个发卡结构末端的能量供受体距离都被拉开,FAM的荧光恢复,且靶物和H0进入下一个反应。此时一个X型DNA上含有四个FAM荧光染料,靶物循环结合四个荧光分子聚集在一个产物DNA上实现了双信号放大的策略。并且随着靶物miR-21浓度的增加,FAM的荧光强度逐渐增强,靶物浓度在0.1 nM-3.2 nM范围内呈现出很好的线性关系,检测限为0.02 nM（三倍标准偏差计算法,n=11）,相比于只有CHA,双信号放大的检测灵敏度提高了5.7倍。相比于一个X型DNA上只有一个荧光染料,双信号放大的检测灵敏度提高了11.3倍。另外,本反应1小时即可结束,反应时间短可避免miRNA降解。因此该方法实现了高灵敏检测miR-21的目的。综上所述,本研究以能量转移为技术手段,采用简单、快速的方法制备光稳定性强、生物相容性好以及表面富含羧酸官能团的s-GQDs,表面丰富的羧基使其成功修饰并用于能量转移体系的构建,实现miR-21的检测,该s-GQDs还具有Dy³⁺诱导聚集荧光猝灭以及磷酸根竞争配位Dy³⁺使得s-GQDs荧光再恢复的关开效应,可以应用于检测磷酸根。利用QDs与AuNPs联合BHQ2构建双重能量转移探针,实现对非酒精性脂肪肝细胞中miR-21低背景成像分析,再通过无酶参与的CHA循环方法形成X型DNA,利用双信号放大的原理实现对miR-21高灵敏检测。本研究为富含官能团的能量供体合成提供了新的方法,同时也为低背景能量转移体系的构建以及高灵敏检测疾病标志物miR-21提供了新思路。