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目的 导致急性淋巴细胞白血病（ALL）复发的主要原因是微小残留病（MRD），故监测MRD对ALL患者的病情和治疗效果判断、早期预测复发等预后分析、以及决定进一步治疗策略有重要的意义。研究已经证明T细胞受体（TCR）基因的可变区（V）和连接区（J）片段在干细胞向淋巴系分化时会发生特异性重排，形成每个淋巴细胞克隆特有的V-D-J片段，可作为基因标志应用于ALL等恶性血液病微小残留病（MRD）的检测。目前国内常规检测TCR基因重排主要是定性聚合酶链反应（PCR）技术，虽然单纯定性PCR检测可以发现MRD，但临床发现其实际意义有限，因为同样有MRD存在的病人可能出现复发，也有部分病人的病情却一直缓解，这反映了ALL患者的MRD存在数量上的差异。同时常规PCR方法还有假阳性、非特异扩增、扩增后电泳操作所致误差及EB染色对人体有害等问题。本研究课题就是为克服目前存在的上述问题，进一步提高白血病患者MRD检测的临床应用价值，建立实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测ALL病人T细胞受体（TCR）VγI-Jγ基因重排的方法，为临床ALL治疗的研究提供更准确的依据。 方法 取36例病情分别处于初治、化疗后完全缓解（CR）、造血干细胞移植术（HSCT）后的ALL患者的36份骨髓样本作为本课题研究的标本，其定性PCR方法检测TCRVγI-Jγ基因重排均为阳性，应用经典NP40-蛋白酶K消化，酚一氯仿抽提其骨髓单个核细胞的DNA，同时取10名正常献血员的单个核细胞的DNA为阴性对照。由于TCRVγI-Jγ的J片段在重排过程中比较恒定，随机抽取3例TCRVγI-Jγ基因重排阳性的PCR产物经纯化后进行序列分析，结合Genbank中TCRVγI-Jγ序列的同源性分析，选取了TCR J片段一个保守区域作为靶区域，应用专业引物探针设计软件，设计出特异的引物和探针。用1例骨髓白血病细胞占98％的TCRVγI-Jγ基因重排阳性ALL患者PCR产物经纯化后与pMD 18-T Vector连接并转化到大肠杆菌DH5α，筛选出阳性重组子，提取质粒DNA并测定其OD值，以0.5μg／2.5μl折算100／2.5μl基因水平，用TE缓冲液10倍稀释成100～10-5水平标准品DNA模板，置于ABI PRISM 7000荧光定量PCR扩增仪上，按照设置及说明进行实时荧光定量PCR扩增，构建出标准曲线。然后用相同方法对上述36例ALL患者（TCR） V Yl一JY重排基因进行定量检测。 结果1.以100一10礴不同稀释度的标准品DNA模板进行荧光定量PCR扩增，CT值分别为2 1 .08、24.34、27.53、30.58和33.25。统计学分析显示每个标准品的CT值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系，起始浓度越高，CT值越小，回归系数为0.998，线性关系好。 2.以100一10一不同稀释水平的阳性标准模板DNA进行荧光定量PCR扩增后在10--’水平仍可得到确定的CT值，说明本研究构建的适时荧光定量PcR方法的灵敏度达1 04水平。 3.对浓度分别为100一。一3标准品DNA模板1、Ix、111、IV重复6管定量，每个数量级的重复性较好，其变异系数分别为7.44%、5.43%、6.01%和7.28%。对浓度为10一3标准品oNA模板用试剂I、11、111、IV、v、vl定量检测，由于反应系统中各成分相对稳定，不同时间配制的试剂稳定性较好，其变异系数6.23%。 4.36例患者荧光定量PCR方法检测TCRV Yl一JY重排基因结果为初治组（7.35士6.65）x 10一2水平，完全缓解（eR）组（1 .02士1.05）、10一2水平，造血干细胞移植术（llseT）组（3.59士5.65）xlo一3水平。eR组和IlseT组TCRV Yl一JY基因重排水平显著低于初治组（P值均为0.001）， HSCT组MRD水平显著低于CR组（P=0.022）。6例HSCT后检测阳性病例中2例MRD水平<1 .00x 10弓，此2例获长期无病生存，另4例MRD水平较高患者一年内均出现复发。 结论1、所构建的TCR VY工一J丫质粒标准品特异性和线性关系好，准确可靠，利于统一标准。 2、所建立实时荧光定量PCR方法快速、灵敏，特异性高，重复性好;且操作简便、安全，更适合临床检测的需要。 3、初步的临床研究表明初治组、CR组及HSCT组三个不同组间模板水平存在显著性差别，cR组及HSCT组的阳性病人的MRD水平也存在较大量的差异，显示定性PCR检测阳性患者其MRD水平是不同的，单纯定性PCR检测并不能说明MRD水平的差异，对临床的指导意义有限。提示实时荧光定量PCR动态观察TCRV Yl一JY基因重排对缓解期ALL病人MRD的检测和预后判断更有意义。