L-核酮糖和L-核糖,是重要的抗癌抗病毒药物的前体物质,对其生物合成进行研究具有重要意义。在L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinoseisomerase,AI)的催化下,L-阿拉伯糖可转化为L-核酮糖,L-核酮糖又经甘露糖-6-磷酸异构酶(mannose-6-phosphate isomerase,MPI)催化生成L-核糖。本文以酿酒酵母孢子为载体分别固定Geobacillus thermodenitrificans来源的AI和MPI,以L-阿拉伯糖为底物,合成L-核酮糖和L-核糖。早期研究表明在酵母OSW2基因缺失的孢子上固定化酶,能承受多种环境胁迫,具有显著优势。本研究将带有目的基因的质粒转入酿酒酵母内,诱导产孢后分别获得孢子固定化AI和MPI,通过Western Blot验证其成功表达,同时通过荧光显微镜观察发现蛋白定位于孢子壁,且孢子固定化AI和MPI具有良好的热稳定性、pH耐受性以及对SDS和蛋白酶处理的抗性。对酿酒酵母产孢方式进行优化,简化产孢流程,提高固定化酶在酿酒酵母孢子内的蛋白表达,提升酿酒酵母孢子固定化酶催化活性。以L-阿拉伯糖为底物合成L-核酮糖,其最适反应条件为:100 g·L-1 L-阿拉伯糖,10 g·L-1孢子固定化AI,2mmol·L-1Mn2+ pH 8.0(Tris-HCl),70℃ 反应 4h。在放大的反应中(10mL),1g L-阿拉伯糖可产生0.25 g L-核酮糖,转化率为25%。经Ca2+离子交换柱纯化反应液,L-核酮糖回收率约为91%。通过定点突变获得MPI突变体(W17Q,N90A,L129F),以L-核酮糖为底物合成L-核糖,转化率提高至63%。最适反应条件为:70℃,1 mmol·L-1 Co2+,pH 7.0(PIPES)。以L-阿拉伯糖为底物,同时加入孢子固定化AI和孢子固定化MPI,合成L-核糖。最适反应条件为:100 g·L-1 L-阿拉伯糖,20 g.L-1孢子固定化AI,30 g.L-1孢子固定化MPI,1mmol·L-1Co2+ pH7.0(PIPES),70℃反应 8h。扩大反应体系至 10mL,在最优条件下,通过两步法合成L-核糖,循环反应四次后将转化率由12%提升至35%,获得0.35 g L-核糖。利用孢子固定化酶进行生物合成,提高酶稳定性的同时安全无毒且操作简便,有利于产物的分离纯化。本研究不仅为L-核酮糖和L-核糖的合成提供了一种简便的方法,并且为稀有糖的酶促转化提供了一种有效的策略。