论文部分内容阅读
宁乡猪作为我国优质的地方品种,其脂肪含量丰富,肌内脂肪分布均匀,同时肌内脂肪酸中不饱和脂肪酸的含量更是高达59.6%,显著高于外来品种杜洛克,大白猪及长白猪。已有研究证明miRNA在脂肪组织生长发育过程中起着调控作用,但miRNA在宁乡猪中的研究相对较少。而环状RNA作为miRNA的上游靶基因,对于miRNA具有海绵吸附作用,因此当miRNA对宁乡猪脂肪组织进行调控的同时环状RNA也会发挥其海绵吸附作用,进而会对脂肪的发育与沉积起着间接调控作用。本研究利用高通量测序技术筛选了对宁乡猪脂肪组织生长发育存在影响的候选miRNA,同时对这些候选miRNA进行了靶基因预测。利用Sanger测序技术,凝胶电泳PCR技术,实时荧光定量PCR技术（q RT-PCR）,RNase R耐受性实验,荧光原位杂交实验（FISH）等对本课题组前期通过深度测序得到的环状RNA——Circ＿22931和Circ＿7903进行了成环验证和细胞分布检测,具体结果如下:1.利用测序手段得到了宁乡猪30天脂肪组织中raw reads共16855381条,其中clean reads为16750418;210天脂肪组织中raw reads共26308855条,其中clean reads为1130236条。2.将30d与210d的脂肪组织测序数据进行对比分析,得到了差异表达的已知miRNA 383个,其中极显著差异表达的miRNA 97个,在这97个miRNA中31个表达上调,66个表达下调。同时还筛选出495个差异显著的新预测miRNA,其中有393个表达下调,102个表达上调。挑选其中差异极显著的各10个miRNA进行了表达量分析和靶基因预测,发现这20个miRNA都能预测到与脂肪相关的靶基因如:SLC27A1-204、FAR1-201、ELOVL5-201、FAR2-201等。3.基于本课题组前期对宁乡猪环状RNA的研究,挑选出可能与宁乡猪脂肪生长有关的环状RNA——Circ＿7903和Circ＿22931,通过设计引物对这两个环状RNA进行序列扩增,同时将扩增之后的序列进行Sanger测序,将测序得到的序列跟原序列进行比对,验证引物的可靠性,利用凝胶电泳PCR技术对环状RNA进行成环验证。同时利用miRanda软件将前期挑选的10个已知miRNA与Circ＿7903和Circ＿22931进行了互作分析,发现Circ＿7903与ssc-miR-31和ssc-miR-9843-3p具有互作关系,而ssc-miR-31和ssc-miR-9843-3p又都预测到了与脂肪合成相关的靶基因,由此建立了环状RNAmiRNA-靶基因-脂肪组织的一个调控网络。4.利用实时荧光定量PCR技术研究了Circ＿7903和Circ＿22931在宁乡猪脂肪组织中30d、90d、150d和210d的时间表达谱,确定了Circ＿7903和Circ＿22931的表达量随着宁乡猪的发育即脂肪的沉积而增长。同时利用荧光原位杂交技术（FISH）对于circ＿7903和circ＿22931在宁乡猪脂肪细胞中的分布进行了检测。总而言之,本研究从转录组水平揭示了宁乡猪脂肪相对含量较高的原因,筛选了与宁乡猪脂肪发育生长相关的候选miRNA,同时对与宁乡猪脂肪沉积相关的环状RNA进行了初步的验证和研究,构建了环状RNA-miRNA-靶基因的调控网络,为研究宁乡猪肌内脂肪这一优质肉品质性状提供理论基础。