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背景和目的多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种浆细胞异常增生性疾病,是血液系统中第二大常见的恶性肿瘤。血管生成是MM生长的首要条件,探讨MM血管生成机制并抑制其血管生成对MM患者的治疗和长期生存具有重要意义。血管内皮生长因子 A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)是最主要的促血管生长因子,可与血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)特异性结合,刺激血管内皮细胞(vein endothelial cell,VEC)增殖和迁移,在肿瘤血管生成过程中发挥重要作用。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)是肿瘤微环境的重要组成部分,能够分泌血管内皮生长因子、血管生成素、血小板衍生因子等促进血管生长的细胞因子,进而影响肿瘤血管的发生发展。研究发现,VEGFA siRNA转染MM细胞后,MM细胞中VEGFA表达下调,然而MM血管的生成并没有明显减少,因此推测单纯抑制MM细胞VEGFA的表达不能达到抑制MM血管生成的目的,可能存在包括TAMs在内的肿瘤微环境因素也影响着MM血管生成。为探讨MM细胞和TAMs是否协同影响MM血管生成,本实验采用人单核细胞白血病细胞(THP-1)诱导分化为Ml型和M2型TAMs,再分别与VEC共培养,同时用VEGFA siRNA分别转染M2型TAMs和骨髓瘤RPMI 8226细胞,并收集转染前后细胞培养基作为条件培养基培养VEC,利用CCK8增殖实验、Transwell迁移实验和小管形成实验比较各组VEC增殖、迁移以及成管能力;采用ELISA实验检测各组培养基中VEGFA浓度;采用qRT-PCR、Western blot技术检测各组VEC中VEGFR1 mRNA和蛋白的表达。探究M1,M2型TAMs对MM血管生成的影响,以及MM细胞与TAMs是否能协同促进MM血管的生成,为MM的治疗提供新的思路。材料和方法1 M1,M2型TAMs体外诱导将 THP-1 细胞在含有佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)浓度为100 ng/ml的培养基中培养48 h后,更换含有白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)浓度为20 ng/ml的培养基继续培养48 h得到M2型TAMs;更换同时含有干扰素Y(interferon-γ,IFN-γ)浓度为 50 ng/ml 和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)浓度为100 ng/ml的培养基继续培养48 h得到M1型TAMs。2 M1,M2型TAMs对VEC体外增殖、迁移以及成管能力的影响2.1 M1,M2型TAMs与VEC共培养在0.4 μm Transwell小室上室将THP-1细胞分别诱导成M1,M2型TAMs,然后在下室种植VEC共培养48 h。共培养分组如下:NC组:正常培养基培养的VEC;co-M2组:与M2型TAMs共培养的VEC;co-M1组:与M1型TAMs共培养的VEC。2.2检测各组相关指标(1)利用ELISA法检测各组培养基上清液中VEGFA的浓度;(2)利用CCK8法检测各组VEC的增殖能力;(3)利用Transwell迁移法检测各组VEC的迁移能力;(4)利用小管形成实验检测各组VEC的成管能力;(5)利用qRT-PCR法检测各组VEC中VEGFR1 mRNA的表达;(6)利用Western blot法检测各组VEC中VEGFR1蛋白的表达。3 VEGFA siRNA转染骨髓瘤RPMI8226细胞和M2型TAMs前后对VEC体外增殖、迁移以及成管能力的影响3.1 VEGFA siRNA的构建与转染针对人源VEGFA siRNA设计了三条干扰序列,将三条序列分别转染骨髓瘤RPMI 8226细胞,用qRT-PCR法检测转染后VEGFA mRNA的表达量,通过对比挑选出最佳干扰序列。3.2条件培养基的收集与分组分别收集RPMI 8226细胞和M2型TAMs转染前后的培养基作为条件培养基培养VEC,并分组如下:(1)转染前:NC组:正常培养基培养VEC;RP组:RPMI 8226细胞培养基作为条件培养基培养VEC;M2组:M2型TAMs培养基作为条件培养基培养VEC;RP+M2组:RPMI 8226细胞培养基与M2型TAMs培养基的混合培养基作为条件培养基培养VEC。(2)转染后:RP+M2组:RPMI 8226细胞培养基与M2型TAMs培养基的混合培养基作为条件培养基培养VEC;siRP+M2组:转染后的RPMI 8226细胞培养基与M2型TAMs培养基的混合培养基作为条件培养基培养VEC;siM2+RP组:转染后的M2型TAMs培养基与RPMI 8226细胞培养基的混合培养基作为条件培养基培养VEC;siRP+siM2组:转染后的RPMI 8226细胞培养基与转染后的M2型TAMs培养基的混合培养基作为条件培养基培养VEC。3.3检测转染前后各组相关指标相关指标检测方法同2.2。4统计学处理实验相关数据使用SPSS 21.0软件进行分析,以均数±标准差(x±S)来表示,多组间的差异通过单因素方差分析(ANOVA)。检验水准α=0.05。所有实验均独立进行3次。结果1 M1,M2型TAMs对VEC体外增殖、迁移以及成管能力的影响1.1 各组VEC培养基上清液中VEGFA浓度通过ELISA法检测各组共培养VEC培养基上清液中VEGFA浓度。co-M2组培养基上清液中VEGFA浓度明显高于NC组(P<0.05),co-M1组培养基上清液中VEGFA浓度明显低于NC组(P<0.05)。1.2 各组VEC增殖能力情况通过CCK8法检测各组VEC增殖能力。co-M2组VEC增殖能力明显高于NC组(P<0.05),co-M1组VEC增殖能力明显低于NC组(P<0.05)。1.3 各组VEC迁移能力情况通过Transwell迁移法检测各组VEC迁移能力。co-M2组VEC迁移能力明显高于NC组(P<0.05),co-M1组VEC迁移能力明显低于NC组(P<0.05)。1.4各组VEC体外成管能力通过基质胶小管形成实验检测各组VEC体外成管能力。co-M2组VEC成管能力明显高于NC组(P<0.05),co-M1组VEC成管能力明显低于NC组(P<0.05)。1.5 各组VEC中VEGFR1 mRNA表达情况通过qRT-PCR实验检测各组VEC中VEGFR1 mRNA的表达量。co-M2组VEC中VEGFR1 mRNA的表达量是NC组的5倍,明显高于NC组(P<0.05),co-M1组VEC中VEGFR1 mRNA的表达量则明显低于NC组(P<0.05)。1.6 各组VEC中VEGFR1蛋白表达情况通过Western blot法检测各组VEC中VEGFR1蛋白的表达。co-M2组VEC中VEGFR1蛋白的表达量明显高于NC组(P<0.05),co-M1组VEC中VEGFR1蛋白的表达量明显低于NC组(P<0.05)。2 骨髓瘤RPMI 8226细胞与M2型TAMs对VEC体外增殖、迁移以及成管能力的协同影响2.1 各组VEC培养基上清液中VEGFA浓度通过ELISA法检测各组VEC培养基上清液中VEGFA浓度。与NC组相比,RP组、M2组、RP+M2组培养基上清液中VEGFA浓度均增高(P<0.05),其中RP+M2组培养基上清液中VEGFA浓度最高(P<0.05)。2.2 各组VEC增殖能力情况通过CCK8法检测各组VEC增殖能力。与NC组相比,RP组、M2组、RP+M2组VEC增殖能力均增强(P<0.05),其中RP+M2组VEC增殖能力最强(P<0.05)。2.3 各组VEC迁移能力情况通过Transwell迁移法检测各组VEC迁移能力。与NC组相比,RP组、M2组、RP+M2组VEC迁移能力均增强(P<0.05),其中RP+M2组VEC迁移能力最强(P<0.05)。2.4 各组VEC体外成管能力通过基质胶小管形成实验检测各组VEC体外成管能力。与NC组相比,RP组、M2组、RP+M2组体外成管能力均增强(P<0.05),其中RP+M2组VEC成管能力最强(P<0.05)。2.5 各组VEC中VEGFR1 mRNA表达情况通过qRT-PCR实验检测各组VEC中VEGFR1 mRNA的表达量。与NC组相比,RP组、M2组、RP+M2组VEC中VEGFR1 mRNA表达量均增多(P<0.05),其中RP+M2组VEC中VEGFR1 mRNA表达量最多(P<0.05)。2.6 各组VEC中VEGFR1蛋白表达情况通过Western blot法检测各组VEC中VEGFR1蛋白的表达。与NC组相比,RP组、M2组、RP+M2组VEC中VEGFR1蛋白表达量均增多(P<0.05),其中RP+M2组VEC中VEGFR1蛋白的表达量最多(P<0.05)。3 VEGFA siRNA转染骨髓瘤RPMI 8226细胞与M2型TAMs后,对VEC体外增殖、迁移以及成管能力的影响3.1 挑选最佳干扰序列将设计合成的三条VEGFA siRNA序列S1,S2,S3及NC对照序列分别转染对数生长期的RPMI 8226细胞,48h后利用qRT-PCR分别检测各组VEGFA mRNA的表达量。与对照NC序列相比,转染S1,S2,S3序列后,各组VEGFA mRNA的表达量均明显降低(P<0.05),其中S1序列组VEGFA mRNA的表达量最低,因此后续实验采用该序列作为转染序列。3.2 转染后各组VEC培养基上清液中VEGFA浓度通过ELISA法检测转染后各组VEC培养基上清液中VEGFA浓度。与RP+M2组相比,siRP+M2组、siM2+RP组、siRP+siM2组培养基上清液中VEGFA浓度均降低(P<0.05),其中siRP+siM2组培养基上清液中VEGFA浓度最低(P<0.05)。3.3 转染后各组VEC增殖能力情况通过CCK8法检测转染后各组VEC增殖能力。与RP+M2组相比,siRP+M2组、siM2+RP 组、siRP+siM2 组.VEC 增殖能力均降低(P<0.05),其中 siRP+siM2组VEC增殖能力最低(P<0.05)。3.4 转染后各组VEC迁移能力情况通过Transwell迁移法检测转染后各组VEC迁移能力。与RP+M2组相比,siRP+M2组、siM2+RP组、siRP+siM2组VEC迁移能力均降低(P<0.05),其中siRP+siM2组VEC迁移能力最低(P<0.05)。3.5 转染后各组VEC体外成管能力通过基质胶小管形成实验检测转染后各组VEC体外成管能力。与RP+M2组相比,siRP+M2组、siM2+RP组、siRP+siM2组VEC成管能力均降低(P<0.05),其中siRP+siM2组VEC成管能力最低(P<0.05)。3.6 转染后各组VEC中VEGFR1 mRNA表达情况通过qRT-PCR实验检测转染后各组VEC中VEGFR1 mRNA的表达量。与RP+M2 组相比,siRP+M2 组、siM2+RP 组、siRP+siM2 组 VEC 中 VEGFR1 mRNA表达量均降低(P<0.05),其中siRP+siM2组VEC中VEGFR1 mRNA表达量最低(P<0.05)。3.7 转染后各组VEC中VEGFR1蛋白表达情况通过Western blot法检测转染后各组VEC中VEGFR1蛋白的表达。与RP+M2组相比,siRP+M2组、siM2+RP组、siRP+siM2组VEC中VEGFR1蛋白表达量均降低(P<0.05),其中siRP+siM2组VEC中VEGFR1蛋白表达量最低(P<0.05)。结论1.M2型TAMs可促进VEC增殖、迁移及成管,而M1型TAMs可抑制VEC增殖、迁移及成管。2.骨髓瘤RPMI 8226细胞和M2型TAMs可协同促进VEC增殖、迁移及成管,同时抑制骨髓瘤RPMI 8226细胞和M2型TAMs中VEGFA的表达,体外可协同抑制VEC增殖、迁移及成管。3.骨髓瘤RPMI 8226细胞和M2型TAMs产生的VEGFA可能通过受体VEGFR1发挥作用。