脂类是维持细胞正常生理功能并保持机体平衡的重要生物大分子,包括脂肪和类脂。脂类的来源主要有两个:外源性和内源性。外源性的甘油三酯和胆固醇主要来自食物的摄取,内源性的主要在机体内合成。现代社会中,由于生活方式的改变,脂质和脂蛋白代谢异常引发的高脂血症、肥胖、糖尿病、心血管疾病、肥胖、非酒精性脂肪肝等诸多慢性非传染性疾病呈显著上升态势,所以研究脂质代谢调节机制,包括模型的制造、药物的干预和治疗至关重要。五味子素B（SchisandrinB,Sch B）是中药五味子中含量最高的联苯环辛烯类木质素类,小剂量具有良好的保肝作用。课题组前期研究发现大剂量Sch B一次灌胃12h后血TG水平开始升高,24 h达峰值,持续72 h;肝TG含量12 h后开始升高,48 h达高峰,持续到96h;附睾脂肪重量12h后开始降低,48h达峰值,持续72h。本研究进一步观察SchB对正常及高脂/糖饮食小鼠脂代谢的影响,并利用脂质组学及基因芯片技术探讨其作用机制。同时在体外探讨Sch B对小鼠前脂肪细胞增殖、分化及脂肪细胞因子分泌的影响,并阐明其分子机理,为五味子素B制造高甘油三酯血症动物模型提供实验依据。1.Sch B对正常小鼠脂代谢的影响目的:观察Sch B一次给药对正常饮食小鼠血/肝脂和葡萄糖（GLU）,以及血载脂蛋白、游离脂肪酸、脂代谢相关酶活性、脂肪细胞因子、肝细胞生长因子的影响,同时记录附睾脂肪重量/细胞体积、肝重/功能、肝细胞结构的影响。方法:小鼠分为对照组、SchB0.5、1、2g/kg组,非诺贝特（FF）0.15 g/kg组,用橄榄油或CMC（0.5%）配制。给药48 h后眼眶取血,生化法测定甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、载脂蛋白A1（Apo A1）水平;ELISA法测定极低密度脂蛋白（VLDL）、载脂蛋白B48（Apo B48）、载脂蛋白B100（Apo B100）、载脂蛋白 CⅡ（ApoCⅡ）、载脂蛋白 CⅢ（Apo CⅢ）、载脂蛋白 E（Apo E）、游离脂肪酸（FFA）、瘦素、脂联素、内脂素、抵抗素、白介素-6（IL-6）、肝细胞生长因子（HGF）水平,卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT）、敏感脂酶（HSL）、脂蛋白酯酶（LPL）、肝酯酶（HL）谷丙转氨酶（ALT）活性;称重法测定小鼠肝/脂肪重,计算指数;常规HE染色观察肝/脂肪组织细胞结构,油红O染色观察肝脏组织脂质分布;记录实验过程小鼠体重变化、摄食/水量。结果:1、（1）用橄榄油配制Sch B（1g/kg）小鼠血TG和TC水平分别升高111%和10%,FF降低血TG水平23%。用CMC配制相同剂量的Sch B,血TG升高41%,TC升高18%。橄榄油与CMC配制对SchB升高血脂水平有显著差异。（2）橄榄油/Sch B 0.25、0.5、1、2 g/kg 可剂量依耐性升高血 TG（32%-266%）和 TC（4%-37%）水平。2、（1）橄榄油/SchB 1g/kg可显著升高肝脏TG（164%）、TC（38%）含量,降低肝脏GLU（12%）含量,橄榄油/FF可显著降低肝脏TG（37%）、TC（25%）、GLU（21%）含量。CMC/SchB 1 g/kg组小鼠肝脏GLU含量降低16%,CMC/FF可显著降低肝脏TG（65%）、TC（65%）、GLU（16%）含量。（2）橄榄油/SchB0.25、0.5、1、2g/kg 剂量依赖性增加肝脏TG含量（57%-353%）,降低肝脏GLU含量（11%-34%）,SchB 1g/kg可显著升高肝脏TC含量（18%）,FF可显著降低肝脏TG（38%）、TC（38%）、GLU（21%）含量。CMC/SchB2g/kg可显著升高肝脏TG（243%）、TC（43%）含量,降低肝脏GLU（22%）含量。3、SchB给药48h后,血HDL、LDL水平分别升高25%-30%和 26%-31%,VLDL、Apo B100、Apo CⅡ、ApoCⅢ、ApoE 水平分别降低 13%-16%,20%-21%,21%,18%和 11%-29%,Sch B 0.5、1 g/kg 分别降低 Apo B48 16%和 16%,但 Sch B 2 g/kg 升高 Apo B48 97%。4、Sch B 0.5、1g/kg 给药后 48 h,小鼠血 FFA 水平显著下降16%和18%,但2 g/kg组小鼠血FFA显著升高（37%）。5、Sch B给药后48 h,血清LCAT、LPL、HSL活性分别降低48%、22%和22%。6、Sch B 1、2g/kg给药48h可显著降低小鼠附睾脂肪重量及脂肪指数,缩小脂肪细胞横切面积,降低血清瘦素、脂联素、内脂素的水平。7、SchB 0.5、1、2 g/kg给药48 h,显著升高肝脏重量（14%-34%）和肝指数（20%-52%）,并升高血HGF水平（4%-30%）,但对ALT活性无明显影响。8、肝脏HE染色结果显示Sch B给药48 h后,肝脏出现空泡样脂肪病变,油红O染色结果显示肝脏脂质堆积明显,脂滴面积增加522667%。9、SchB抑制小鼠体重增加,减少摄食/水量。结论:与CMC溶剂比较,用橄榄油配制SchB可以增加其升高血TG水平,而CMC和橄榄油溶剂不影响FF降低血脂的作用;与CMC溶剂比较,用橄榄油配制Sch B可以增加其对肝脏脂质和葡萄糖含量的影响;Sch B在升高血脂水平的同时伴有血载脂蛋白水平的变化,其引起的高甘油三酯血症可能与增加外源性TG合成有关;Sch B可改变小鼠血FFA水平,并呈双向作用,小剂量降低,大剂量增加;SchB可能通过调节脂代谢相关酶的活性而影响小鼠脂代谢;Sch B降低小鼠体内脂肪含量,继而降低血脂肪细胞因子水平,SchB促脂解作用可能是其升高血TG水平的原因之一;SchB一次给药可增加肝脏重量,可能与血HGF水平升高和脂肪沉积有关;HE和油红O染色显示Sch B可促进肝脏脂质堆积,但可抑制小鼠体重的增加量。2.Sch B对高脂/糖饮食小鼠脂代谢的影响目的:观察SchB一次给药对高脂/糖饮食（HFFD）小鼠血/肝脂、血/肝葡萄糖、血载脂蛋白、血游离脂肪酸、血脂代谢相关酶活性、血脂肪细胞因子、血肝细胞生长因子、附睾脂肪重量/细胞体积、肝重/功能、肝细胞结构的影响。方法:小鼠分对照组、高脂/糖（HFFD）饮食组、HFFD/Sch B 0.5、1、2 g/kg组。对照组用正常饲料喂养,模型及模型给药组食用HFFD饲料,SchB于第8天灌胃给药,给药48 h后眼眶取血,生化法测定TG、TC、HDL、LDL、Apo A1水平;ELISA法测定 VLDL、Apo B48、Apo B100、Apo CⅡ、ApoCⅢ、ApoE、FFA、瘦素、脂联素、内脂素、抵抗素、IL-6、HGF水平,LCAT、HSL、LPL、HL和ALT活性;称重法测定小鼠肝/脂肪重,计算指数;常规HE染色观察肝/脂肪组织细胞结构,油红O染色观察肝脏组织脂质分布。结果:1、与对照组相比,HFFD组小鼠血TC、GLU水平分别升高18%和17%,SchB升高HFFD组小鼠血TG水平（65%-317%）。2、与对照组相比,HFFD升高肝TG（107%）和TC（49%）含量。与HFFD相比,HFFD/SchB组小鼠肝TG和TC含量分别升高 257%-466%和 29%-102%,Sch B 降低 HFFD/GLU 含量 37%-32%。3、与对照组相比,HFFD组小鼠血清VLDL水平升高15%。与模型组相比,HFFD/Sch B组小鼠血清 HDL（21%-36%）、LDL（27%）、VLDL（21%-34%）、ApoB100（21%-32%）、Apo CⅡ（22%-26%）、和 Apo E（17%-19%）水平均降低;而 Apo B48（94%）水平升高。4、大剂量SchB（2 g/kg）可显著升高HFFD喂养小鼠血FFA水平（33%）。5、与对照组相比,HFFD可显著升高血HSL活性（94%）。Sch B可显著降低HFFD喂养小鼠血LCAT（28%-39%%）和 LPL（28%）活性。Sch B 0.5 g/kg 降低 HSL 活性 25%,但 Sch B 2 g/kg升高HSL活性43%。6、与对照组相比,HFFD可显著升高小鼠附睾脂肪重量（52%）和指数（50%）、血清抵抗素（24%）及白介素-6（89%）水平。与HFFD相比,SchB可显著降低小鼠附睾脂肪重量（52%）/指数（50%）/血清瘦素（51%-56%）、脂联素（39%）、抵抗素（28-31%）和内脂素（19%-24%）,但血清白介素-6水平升高67%,脂肪横切面积显著缩小（36%）。7、与对照组相比,HFFD可显著升高小鼠血清HGF水平（48%）,但对小鼠肝脏重量及对血清ALT活性无明显影响。SchB可显著升高HFFD喂养小鼠的肝脏重量（38%-64%）和肝脏指数（35%-68%）,升高血清HGF水平29%,但降低HFFD小鼠血清ALT活性23%。8、肝脏HE染色结果显示,HFFD与对照组相比无明显差异。SchB给药48h后,HFFD小鼠肝脏出现空泡样脂肪病变,油红O染色结果显示肝脏脂质堆积明显。9、HFFD组小鼠体重增加0.39 g,HFFD/Sch B 0.5、1、2 g/kg组小鼠体重分别增加0.21 g,-0.07 g,-0.58 g,Sch B对HFFD喂养小鼠的摄食/水量无明显影响。结论:SchB与HFFD联合应用可制造混合型高脂血症动物模型,SchB在影响HFFD小鼠肝脏脂代谢的同时也影响肝糖的代谢;Sch B调节HFFD小鼠血脂的机制可能是影响了脂蛋白的代谢及脂代谢相关酶的活性,同时Sch B可促进HFFD小鼠脂肪的分解,升高HFFD小鼠血FFA水平,并降低血细胞脂肪因子水平,可能是其升高血TG的原因之一;Sch B升高HFFD小鼠肝脏重量可能与增加HGF水平有关;通过HE染色显示Sch B一次给药后可促进HFFD小鼠肝脏脂质堆积,但Sch B可显著抑制HFFD喂养小鼠的体重增加。3.基于脂质代谢组学分析Sch B对正常和高脂/糖饮食小鼠脂代谢的干预作用目的:观察Sch B对正常及高脂/糖饮食小鼠血清脂代谢物的影响。方法:小鼠分为正常对照组、Sch B 2g/kg（正常饮食）、HFFD组、HFFD/Sch B 2 g/kg组。对照组食用正常饲料,模型及模型给药组食用HFFD,Sch B于第8天灌胃给药,48 h后眼眶取血进行脂质代谢组学测定。结果:鉴定出Sch B引起正常饮食小鼠脂质代谢变化的潜在生物标志物有28个,其中包括19个TG,7个PC,2个PE,其中PE下降,其他均升高。鉴定出SchB引起高脂/糖饮食小鼠脂质代谢变化的潜在生物标志物有25个,其中包括15个TG,5个PC,4个PE,1个CE,其中PE下降,其他均升高。结论:Sch B升高血TG代谢生物标志物。4.基于全基因表达谱分析Sch B对正常及高脂/糖饮食小鼠脂代谢干预作用的通路研究目的:分析肝脏和脂肪组织全基因表达谱的变化,探讨Sch B引起血TG升高的机制。方法:小鼠分为正常对照组（C）、SchB2g/kg（CB）、高脂/糖饮食组（M）、SchB2 g/kg（MB）组。C和CB组食用正常饲料,M及MB组食用HFFD饲料,Sch B于第8天灌胃给药,48h后取肝脏和附睾脂肪组织做全基因芯片检测,采用基因功能分类和通路功能总结方法分析芯片结果。结果:脂肪组织基因芯片结果显示,CB和C相比,592个基因下调,547个基因上调;M和C相比,421个基因下调,369个基因上调;MB和M相比,370个基因下调,422个基因上调。肝脏组织基因芯片结果显示,CB和C相比,294个基因下调,722个基因上调;M和C相比,781个基因下调,1289个基因上调;MB和M相比,491个基因下调,671个基因上调。通路分析显示:SchB可能影响PPAR signalingpathway、Steroid biosynthesis、Insulin signaling pathway、Adipocytokine signaling pathway、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 等通路,如 Ppara、Fabp1、Rxrg、Ucp1、Fasn、Acaca、Prkag2、Lep、Npy、Ce1、Cyp2b 等。结论:SchB引起血TG升高与PPAR信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子、固醇合成、P450诱导的外源性物质等代谢通路有关。5.Sch B对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响及机制研究目的:观察Sch B对前脂肪细胞向脂肪细胞分化、细胞甘油三酯积聚及脂肪因子基因表达的影响。方法:培养小鼠3T3-L1前脂肪细胞,用经典鸡尾酒法诱导分化,分化第一天开始用Sch B干预。分化结束用油红O染色法测定细胞内脂滴积聚,RT-PCR检测CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPα）、脂肪酸合成酶（FAS）、过氧化物酶增殖物激活受体（PPAR-γ）、脂肪细胞脂质结合蛋白（aP-2）、激素敏感性脂酶（HSL）、瘦素（Leptin）、脂联素（Adiponectin）、抵抗素（Resistin）基因表达。结果:SchB可显著抑制脂滴的积聚,降低C/EBPα FAS、PPAR-γ、aP-2、HSL、Leptin、Adiponectin、Resistin mRNA 的表达。结论:SchB可抑制3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化,降低脂滴的积聚,这与其抑制细胞分化过程中转录因子C/EBPα、PPAR-γ及下游与脂肪代谢调节相关的基因aP-2和FAS基因表达有关。SchB可下调脂肪因子Leptin、Adiponectin、Resistin基因表达,可能与降低C/EBP α、PPAR-γ有关。