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无形体自然感染调查与分离鉴定:
一、研究背景
嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum,AP),又叫粒细胞无形体(以下简称无形体),是一种革兰氏染色阴性,专细胞内寄生菌。该菌主要通过媒介蜱-宿主在自然界中维持,人进入疫源地被带菌蜱叮咬后可能感染病原体患人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)。该病原体可以引发牛牧场热(Pasture fever)和羊蜱咬热(Tick-borne fever,TBF),危害畜牧业造成巨大的经济损失(1-2)。自1994年美国实验室确诊第一例HGA以来,发病呈上升趋势,1994年～2002年9年共报告发病人数为2135例,2003年336例,2004年,538例,2005年700例,2006和2007年均超过500例。1999年美国将该病定为国家法定传染病。此外在斯洛文尼亚,瑞典、奥地利,西班牙,爱莎维亚等欧洲国家也有病例报道。欧洲牧场热和蜱咬热是动物中分布最广泛的蜱媒传染病。
近年来我国在无形体病流行病学研究方面已取得了显著进展。本研究室于1997年在我国首次从大小兴安岭林区全沟硬蜱检测到无形体的基因片段。并证实我国东北林区为HGA潜在疫源地,蜱和野鼠存在无形体自然感染。2006年11月安徽省宣城市某县出现HGA小爆发,报道了10例疑似HGA病例,其中1例原发病例死亡,继发9病例,怀疑该病原体可能通过人-人传播;此后河南、浙江和海南等省相继也有疑似HGA报道。2008年2月卫生部印发《人粒细胞无形体病预防控制技术指南(试行)》,要求若发现HGA疑似或确诊病例应参照乙、丙类传染病报告要求于24小时内进行网络直报;并需全面提高医务人员对HGA的认识,加强预防控制工作。
作为新发传染病,我们对HGA及其致病菌的认识还非常局限。有许多亟需解决的问题,如:(1)我们仅对东北地区媒介蜱种有初步了解,其他大部分地区情况不明,东北地区、东南、西南等地区有待继续查明;(2)宿主动物的种类,分布情况如何,公共卫生危害怎样?(3)我国AP遗传特征、毒力、致病性、宿主倾向性如何?据此,本课题针对无形体的传播媒介、宿主动物进行分子流行病学调查,在此基础上进行病原体分离鉴定,拟开展林区高危人群血清流行病学调查。
二、研究目的:
主要包括:1、阐明我国无形体主要传播媒介、宿主动物种类、构成和感染情况;2、分离培养无形体;3、了解我国不同地区、不同媒介宿主来源无形体的遗传进化特征,预测不同变异株的宿主倾向性及公共卫生危害。
三、研究方法
1.现场调查以东北吉林延边林区为调查重点,同时开展包括东北黑龙江林区、北部内蒙古自治区林区,西北新疆维吾尔族自治区山林;东南浙江省丘陵地区,西南贵州山区等5个调查点的调查。地形地貌包括森林,高山,丘陵等;跨中温带季风性海洋气候,温带大陆性季风气候,寒温带大陆性季风气候,亚热带湿润温和型气候,兼有高原性和季风性气候以及极端干燥的大陆性气候等不同气候条件和生境。
2.媒介蜱种类、构成及感染情况调查采用布旗法拖蜱,并从捕获动物身上检蜱。请专家进行蜱种鉴定,统计不同地区蜱的种类组成。用煮沸法提取DNA,PCR扩增特异的AP基因片断,了解感染率,并进行序列测定和分析。
3.宿主动物种类、构成及感染情况调查从调查点野外用夹夜法或鼠笼捕捉野鼠。鉴定鼠种,计算鼠种群密度。取鼠脾脏研磨成匀浆,提取DNA,扩增特异的AP基因片断,掌握感染状况,进行序列测定和分析。
4.无形体分离
4.1样品采集
经过多年调查发现东北啮齿动物均有无形体感染。从该地区采集样本,进行无形体分离。
4.2用BALB/c鼠培养无形体
样本采集处理后及时经腹腔接种小鼠。接种后10天～14天(DPI10～DPI14)采集尾血进行病原体检测并传代。
4.3细胞培养分离无形体
(1)细胞选择:无形体敏感的人早幼粒细胞(HL60)细胞。
(2)细胞培养常用试剂及器材:1640培养基,Gibco胎牛血清,青霉素,链霉素,两性霉素B,进口培养瓶,甩片离心机。
(3)实验步骤:感染小鼠无菌取血100μl～300μl EDTA-K2抗凝血,接种于2×105至6×105 HL60细胞中。5％CO2培养箱37℃培养。3天换液并且检测细胞感染状态。
4.4感染状况检测鉴定
(1)实时定量PCR检测
以无形体特异的主要外膜蛋白2(major surface protein2,msp2)基因片段为靶基因的实时定量PCR检测。
(2)无形体特异rrs,gltA基因PCR扩增
实时定量PCR检测阳性样本,用无形体特异rrs,柠檬酸盐合成酶基因(gltA)进行扩增序列分析及病原体鉴定。
(3)瑞氏吉姆萨染色
感染小鼠采集尾血做血涂片,或收集感染HL60细胞离心并涂片。自然干燥后甲醇固定10 min。然后用瑞氏吉姆萨染液,根据操作说明染色。显微镜下观察粒细胞内或HL60细胞内无形体生长情况,10X目镜*100X物镜。
(4)电镜观察
采感染动物血液标本1大滴(50 ul)1000 rpm离心10 min或离心收集感染HL60细胞。沉淀用预冷固定液固定2次;用缓冲液(cacodylate buffer)洗3次;然后在1％osmium tetroxide中固定1小时。在逐渐增大浓度的甲醇中脱水,包埋(Epon812);制作超薄切片,染色,镜检(PHILIPS TECNAI10 electron microscope)。
(5)间接免疫荧光检测
①收集感染细胞,PBS洗两遍,涂片,干燥后用1:1丙酮-甲醇固定10 min,-20℃存放备用。
②感染血清收集:感染动物采集血清。56℃灭活。实验时按照1:20,1:40,1:80倍比稀释。
③阳性对照:美国加州大学Janet教授提供无形体感染马血清或PCR阳性感染小鼠血清。
④阴性对照:正常马血清或正常小鼠血清。⑤显微镜下观察
5.基因序列分析
阳性标本PCR扩增gltA基因,msp4基因,groESL基因等。产物纯化、序列测定分析比对,用Mega3.0软件进行遗传进化分析并绘制遗传进化树。
四、主要研究结果:
1.我国南北方林区媒介蜱种类及感染情况
2004年-2005年,4月-6月,共采集媒介蜱951只。其中森林革蜱(Dermacentor silvarum)355只:包括游离森林革蜱327只,寄生蜱28只;全沟硬蜱(Ixodes persulctus)169只,游离蜱100只,寄生蜱69只;寄生中华硬蜱(I.sinesis)400只。总的无形体感染率为0.8％。其中森林革蜱0.6％,全沟硬蜱3.5％,血蜱0,中华硬蜱0。全沟硬蜱感染率高于森林革蜱(经Fisher精确检验,P=0.041),雄性全沟硬蜱感染率高于雌性(经Fisher精确检验,P=0.011),寄生蜱与游离蜱感染率差异无统计学意义(经Fisher精确检验,P=0.186)。
2.我国南北方林区宿主动物种类及感染情况
本研究于2004年到2007年从6个调查点共捕获野鼠705只,20余种。不同地区鼠种差异较大。通过对从小鼠脾脏提取的DNA进行巢式PCR检测,发现有10种以上野鼠存在无形体自然感然,包括黑线姬鼠(A.agrarius),大林姬鼠(A.peninsulae),小林姬鼠(A.sylvaticus),仓鼠(Ricetulus sp.),棕背平鼠(Clethrionomys rufocanus),社鼠(Niviventer confucianus),白腹巨鼠(N.coxingi),黄毛鼠(罗赛鼠)(Rattus losea),褐家鼠(R.norvegicus),小花鼠(Tamias sibiricu)等,平均感染率为5.5％。南北方感染优势鼠种不同。北方黑线姬鼠、仓鼠和大林姬鼠是优势鼠种,东南林区社鼠和小林姬鼠是优势鼠种。东北黑线姬鼠,仓鼠,大林姬鼠,花鼠,褐家鼠和棕背鼠平鼠等6种鼠有无形体感染;而我国东南社鼠,小林姬鼠,褐家鼠,白腹巨鼠,黄毛鼠(罗赛鼠)等5种属感染了无形体。
黑线姬鼠是我国东北林区的优势鼠种,AP感染率高达9.9％,大林姬鼠和仓鼠也广泛活动于我国东北林区,AP感染率分别为5.4％和4.6％;通过05年到09年的长期监测,黑线姬鼠、仓鼠和大林姬鼠是优势鼠种并且存在持续感染。在南方,社鼠和小林姬鼠是优势鼠种,无形体自然感染率分别为5.2％和9.5％。褐家鼠感染率较高,达8.5％,褐家鼠在居民区广泛活动,存在较大公共卫生隐患。其它一些鼠种,如仓鼠,棕背平鼠,白腹巨鼠,黄毛鼠(罗赛鼠),小花鼠等也有无形体感染,但是由于其所占捕获鼠种的比例较少,在无形体传播中的作用有待进一步研究。
3.我国无形体分离鉴定
本研究通过接种BALB/c小鼠和接种HL60细胞在我国乃至亚洲地区首次成功分离3株无形体。其中2株来源于啮齿动物,1株来源于病羊。通过PCR扩增,瑞士-姬姆萨染色,免疫荧光法鉴定,电子显微镜观察及特异序列分析等多种方法鉴定,证实无形体的成功分离。
4.基因序列、遗传进化分析
阳性标本扩增gltA,msp4,groESL部分片断并进行基因序列测定及比对分析,东北全沟硬蜱感染无形体序列与不同鼠种及家畜分离检测的无形体序列相同而与国外报道的AP株不同,属新的无形体株。东南无形体株核苷酸序列也存在变异,亦为AP变异株,东南野鼠和野兔感染无形体株不同。国外研究报道不同AP株对人的致病性不同。遗传进化分析我国分离无形体株与美国对人和家畜致病的无形体株不在同一进化枝,又与野生动物感染无形体株不在同一进化枝。我国发现并成功分离的AP株是否会引起人类疾病以及严重程度如何,还有待进一步研究。
五、结论:
全沟硬蜱和森林革蜱为当地季节优势蜱种,首次确定我国东北林区全沟硬蜱和森林革蜱存在AP自然感染。
南北方优势鼠种不同。我国东北和东南林区10余种野鼠、野兔、家畜存在、并且持续存在无形体自然感染。
在我国乃至亚洲地区首次成功分离到3株无形体,分别来源于黑线姬鼠、仓鼠和发病的羊。多基因序列分析提示东北媒介蜱、啮齿动物和家畜感染无形体相同,与东南野鼠、野兔感染无形体不同。本研究在我国发现3株无形体变异株,其遗传进化分析关系有别于欧美对人致病和非致病株。我国不同AP的致病性、毒力,宿主倾向性及公共卫生危害有待进一步研究。
六、意义与创新
本研究以点带面,多点踏查,发现无形体自然感染主要存在于我国东部地区。全沟硬蜱、森林革蜱和10余种野鼠、野兔和家畜存在无形体的自然感染。在我国发现3株新的无形体株。无形体为细胞内寄生菌,其分离培养有一定难度。本课题通过自然疫源地现场和实验室紧密结合,有的放矢采集无形体感染动物标本,成功的从野鼠和家畜分离了3株无形体,在我国乃至亚洲地区尚属首次。
无形体的成功分离,突破了我国无形体研究的瓶颈,为我国乃至亚洲地区无形体分离提供了行之有效的技术方法,为我国无形体研究水平的提高,为HGA诊断和防治创造了条件.
一、研究背景
嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum,AP),又叫粒细胞无形体(以下简称无形体),是一种革兰氏染色阴性,专细胞内寄生菌。该菌主要通过媒介蜱-宿主在自然界中维持,人进入疫源地被带菌蜱叮咬后可能感染病原体患人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)。该病原体可以引发牛牧场热(Pasture fever)和羊蜱咬热(Tick-borne fever,TBF),危害畜牧业造成巨大的经济损失(1-2)。自1994年美国实验室确诊第一例HGA以来,发病呈上升趋势,1994年～2002年9年共报告发病人数为2135例,2003年336例,2004年,538例,2005年700例,2006和2007年均超过500例。1999年美国将该病定为国家法定传染病。此外在斯洛文尼亚,瑞典、奥地利,西班牙,爱莎维亚等欧洲国家也有病例报道。欧洲牧场热和蜱咬热是动物中分布最广泛的蜱媒传染病。
近年来我国在无形体病流行病学研究方面已取得了显著进展。本研究室于1997年在我国首次从大小兴安岭林区全沟硬蜱检测到无形体的基因片段。并证实我国东北林区为HGA潜在疫源地,蜱和野鼠存在无形体自然感染。2006年11月安徽省宣城市某县出现HGA小爆发,报道了10例疑似HGA病例,其中1例原发病例死亡,继发9病例,怀疑该病原体可能通过人-人传播;此后河南、浙江和海南等省相继也有疑似HGA报道。2008年2月卫生部印发《人粒细胞无形体病预防控制技术指南(试行)》,要求若发现HGA疑似或确诊病例应参照乙、丙类传染病报告要求于24小时内进行网络直报;并需全面提高医务人员对HGA的认识,加强预防控制工作。
作为新发传染病,我们对HGA及其致病菌的认识还非常局限。有许多亟需解决的问题,如:(1)我们仅对东北地区媒介蜱种有初步了解,其他大部分地区情况不明,东北地区、东南、西南等地区有待继续查明;(2)宿主动物的种类,分布情况如何,公共卫生危害怎样?(3)我国AP遗传特征、毒力、致病性、宿主倾向性如何?据此,本课题针对无形体的传播媒介、宿主动物进行分子流行病学调查,在此基础上进行病原体分离鉴定,拟开展林区高危人群血清流行病学调查。
二、研究目的:
主要包括:1、阐明我国无形体主要传播媒介、宿主动物种类、构成和感染情况;2、分离培养无形体;3、了解我国不同地区、不同媒介宿主来源无形体的遗传进化特征,预测不同变异株的宿主倾向性及公共卫生危害。
三、研究方法
1.现场调查以东北吉林延边林区为调查重点,同时开展包括东北黑龙江林区、北部内蒙古自治区林区,西北新疆维吾尔族自治区山林;东南浙江省丘陵地区,西南贵州山区等5个调查点的调查。地形地貌包括森林,高山,丘陵等;跨中温带季风性海洋气候,温带大陆性季风气候,寒温带大陆性季风气候,亚热带湿润温和型气候,兼有高原性和季风性气候以及极端干燥的大陆性气候等不同气候条件和生境。
2.媒介蜱种类、构成及感染情况调查采用布旗法拖蜱,并从捕获动物身上检蜱。请专家进行蜱种鉴定,统计不同地区蜱的种类组成。用煮沸法提取DNA,PCR扩增特异的AP基因片断,了解感染率,并进行序列测定和分析。
3.宿主动物种类、构成及感染情况调查从调查点野外用夹夜法或鼠笼捕捉野鼠。鉴定鼠种,计算鼠种群密度。取鼠脾脏研磨成匀浆,提取DNA,扩增特异的AP基因片断,掌握感染状况,进行序列测定和分析。
4.无形体分离
4.1样品采集
经过多年调查发现东北啮齿动物均有无形体感染。从该地区采集样本,进行无形体分离。
4.2用BALB/c鼠培养无形体
样本采集处理后及时经腹腔接种小鼠。接种后10天～14天(DPI10～DPI14)采集尾血进行病原体检测并传代。
4.3细胞培养分离无形体
(1)细胞选择:无形体敏感的人早幼粒细胞(HL60)细胞。
(2)细胞培养常用试剂及器材:1640培养基,Gibco胎牛血清,青霉素,链霉素,两性霉素B,进口培养瓶,甩片离心机。
(3)实验步骤:感染小鼠无菌取血100μl～300μl EDTA-K2抗凝血,接种于2×105至6×105 HL60细胞中。5％CO2培养箱37℃培养。3天换液并且检测细胞感染状态。
4.4感染状况检测鉴定
(1)实时定量PCR检测
以无形体特异的主要外膜蛋白2(major surface protein2,msp2)基因片段为靶基因的实时定量PCR检测。
(2)无形体特异rrs,gltA基因PCR扩增
实时定量PCR检测阳性样本,用无形体特异rrs,柠檬酸盐合成酶基因(gltA)进行扩增序列分析及病原体鉴定。
(3)瑞氏吉姆萨染色
感染小鼠采集尾血做血涂片,或收集感染HL60细胞离心并涂片。自然干燥后甲醇固定10 min。然后用瑞氏吉姆萨染液,根据操作说明染色。显微镜下观察粒细胞内或HL60细胞内无形体生长情况,10X目镜*100X物镜。
(4)电镜观察
采感染动物血液标本1大滴(50 ul)1000 rpm离心10 min或离心收集感染HL60细胞。沉淀用预冷固定液固定2次;用缓冲液(cacodylate buffer)洗3次;然后在1％osmium tetroxide中固定1小时。在逐渐增大浓度的甲醇中脱水,包埋(Epon812);制作超薄切片,染色,镜检(PHILIPS TECNAI10 electron microscope)。
(5)间接免疫荧光检测
①收集感染细胞,PBS洗两遍,涂片,干燥后用1:1丙酮-甲醇固定10 min,-20℃存放备用。
②感染血清收集:感染动物采集血清。56℃灭活。实验时按照1:20,1:40,1:80倍比稀释。
③阳性对照:美国加州大学Janet教授提供无形体感染马血清或PCR阳性感染小鼠血清。
④阴性对照:正常马血清或正常小鼠血清。⑤显微镜下观察
5.基因序列分析
阳性标本PCR扩增gltA基因,msp4基因,groESL基因等。产物纯化、序列测定分析比对,用Mega3.0软件进行遗传进化分析并绘制遗传进化树。
四、主要研究结果:
1.我国南北方林区媒介蜱种类及感染情况
2004年-2005年,4月-6月,共采集媒介蜱951只。其中森林革蜱(Dermacentor silvarum)355只:包括游离森林革蜱327只,寄生蜱28只;全沟硬蜱(Ixodes persulctus)169只,游离蜱100只,寄生蜱69只;寄生中华硬蜱(I.sinesis)400只。总的无形体感染率为0.8％。其中森林革蜱0.6％,全沟硬蜱3.5％,血蜱0,中华硬蜱0。全沟硬蜱感染率高于森林革蜱(经Fisher精确检验,P=0.041),雄性全沟硬蜱感染率高于雌性(经Fisher精确检验,P=0.011),寄生蜱与游离蜱感染率差异无统计学意义(经Fisher精确检验,P=0.186)。
2.我国南北方林区宿主动物种类及感染情况
本研究于2004年到2007年从6个调查点共捕获野鼠705只,20余种。不同地区鼠种差异较大。通过对从小鼠脾脏提取的DNA进行巢式PCR检测,发现有10种以上野鼠存在无形体自然感然,包括黑线姬鼠(A.agrarius),大林姬鼠(A.peninsulae),小林姬鼠(A.sylvaticus),仓鼠(Ricetulus sp.),棕背平鼠(Clethrionomys rufocanus),社鼠(Niviventer confucianus),白腹巨鼠(N.coxingi),黄毛鼠(罗赛鼠)(Rattus losea),褐家鼠(R.norvegicus),小花鼠(Tamias sibiricu)等,平均感染率为5.5％。南北方感染优势鼠种不同。北方黑线姬鼠、仓鼠和大林姬鼠是优势鼠种,东南林区社鼠和小林姬鼠是优势鼠种。东北黑线姬鼠,仓鼠,大林姬鼠,花鼠,褐家鼠和棕背鼠平鼠等6种鼠有无形体感染;而我国东南社鼠,小林姬鼠,褐家鼠,白腹巨鼠,黄毛鼠(罗赛鼠)等5种属感染了无形体。
黑线姬鼠是我国东北林区的优势鼠种,AP感染率高达9.9％,大林姬鼠和仓鼠也广泛活动于我国东北林区,AP感染率分别为5.4％和4.6％;通过05年到09年的长期监测,黑线姬鼠、仓鼠和大林姬鼠是优势鼠种并且存在持续感染。在南方,社鼠和小林姬鼠是优势鼠种,无形体自然感染率分别为5.2％和9.5％。褐家鼠感染率较高,达8.5％,褐家鼠在居民区广泛活动,存在较大公共卫生隐患。其它一些鼠种,如仓鼠,棕背平鼠,白腹巨鼠,黄毛鼠(罗赛鼠),小花鼠等也有无形体感染,但是由于其所占捕获鼠种的比例较少,在无形体传播中的作用有待进一步研究。
3.我国无形体分离鉴定
本研究通过接种BALB/c小鼠和接种HL60细胞在我国乃至亚洲地区首次成功分离3株无形体。其中2株来源于啮齿动物,1株来源于病羊。通过PCR扩增,瑞士-姬姆萨染色,免疫荧光法鉴定,电子显微镜观察及特异序列分析等多种方法鉴定,证实无形体的成功分离。
4.基因序列、遗传进化分析
阳性标本扩增gltA,msp4,groESL部分片断并进行基因序列测定及比对分析,东北全沟硬蜱感染无形体序列与不同鼠种及家畜分离检测的无形体序列相同而与国外报道的AP株不同,属新的无形体株。东南无形体株核苷酸序列也存在变异,亦为AP变异株,东南野鼠和野兔感染无形体株不同。国外研究报道不同AP株对人的致病性不同。遗传进化分析我国分离无形体株与美国对人和家畜致病的无形体株不在同一进化枝,又与野生动物感染无形体株不在同一进化枝。我国发现并成功分离的AP株是否会引起人类疾病以及严重程度如何,还有待进一步研究。
五、结论:
全沟硬蜱和森林革蜱为当地季节优势蜱种,首次确定我国东北林区全沟硬蜱和森林革蜱存在AP自然感染。
南北方优势鼠种不同。我国东北和东南林区10余种野鼠、野兔、家畜存在、并且持续存在无形体自然感染。
在我国乃至亚洲地区首次成功分离到3株无形体,分别来源于黑线姬鼠、仓鼠和发病的羊。多基因序列分析提示东北媒介蜱、啮齿动物和家畜感染无形体相同,与东南野鼠、野兔感染无形体不同。本研究在我国发现3株无形体变异株,其遗传进化分析关系有别于欧美对人致病和非致病株。我国不同AP的致病性、毒力,宿主倾向性及公共卫生危害有待进一步研究。
六、意义与创新
本研究以点带面,多点踏查,发现无形体自然感染主要存在于我国东部地区。全沟硬蜱、森林革蜱和10余种野鼠、野兔和家畜存在无形体的自然感染。在我国发现3株新的无形体株。无形体为细胞内寄生菌,其分离培养有一定难度。本课题通过自然疫源地现场和实验室紧密结合,有的放矢采集无形体感染动物标本,成功的从野鼠和家畜分离了3株无形体,在我国乃至亚洲地区尚属首次。
无形体的成功分离,突破了我国无形体研究的瓶颈,为我国乃至亚洲地区无形体分离提供了行之有效的技术方法,为我国无形体研究水平的提高,为HGA诊断和防治创造了条件.