论文部分内容阅读
第一部分血红素加氧酶-1在异基因造血干细胞移植患者中的表达及临床意义目的:探讨急性白血病患者异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)前后血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的表达水平,并分析其与急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,a GVHD)的相关性。方法:收集174例行allo-HSCT的急性白血病患者标本及临床资料。采用RT-PCR方法检测患者移植前后HO-1基因表达水平。采用流式细胞术检测80例患者(40例发生a GVHD,40例无a GVHD)移植后的免疫细胞功能。采用双变量相关性分析研究HO-1基因表达与移植后a GVHD发生、复发等的相关性。利用受试者工作特征(ROC)曲线分析移植前后HO-1基因表达水平在a GVHD发生中的预测价值。采用Kaplan-Meier生存曲线,分析HO-1基因表达水平、复发、a GVHD发生等对患者生存的影响。结果:急性白血病患者移植后HO-1基因表达水平较移植前降低。在发生a GVHD患者中,移植后HO-1相对表达量低于未发生a GVHD的同期患者。移植后HO-1相对表达量与CD3~+CD25~+细胞百分比及CD4/CD8比值呈正相关。ROC曲线分析发现,移植后HO-1表达能较好地预测a GVHD的发生,曲线下面积为0.860(0.796～0.924)(P<0.01)。此外,移植前白血病未完全缓解的患者其HO-1基因表达水平高于完全缓解的患者。复发患者移植预处理前HO-1表达明显高于未复发同期患者(P<0.0001)。移植前HO-1基因表达高、移植后复发的的患者预后生存差。结论:移植后HO-1基因表达与a GVHD发生呈负相关,移植后HO-1基因低表达患者其a GVHD发生率更高,对a GVHD发生具有预测作用。HO-1基因表达水平与白血病肿瘤负荷具有相关性。移植预处理前HO-1基因高表达患者复发率高、生存差。第二部分血红素加氧酶-1对异基因活化的T细胞反应的影响目的:探究同基因与异基因移植小鼠体内HO-1基因表达水平的差异,探究HO-1基因表达对T细胞活化的影响,探究体外增强或抑制HO-1对T细胞免疫应答的调节作用。方法:1.本实验采用BALB/c(H2-Kd)小鼠作为受体鼠,BALB/c(H2-Kd)小鼠和C57BL/6(H2-Kb)野生型小鼠作为供体鼠,建立同基因与异基因移植模型。受体鼠接受全身致死性辐照(X-Ray,750c Gy),分别移植BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠来源的1×107骨髓细胞和5×106脾细胞。辐照分两次进行,每次间隔4小时,以缓解胃肠道辐照毒性。移植2周后分离受体小鼠的脾脏、肝脏、肠道、肺脏,RT-PCR检测两组小鼠GVHD靶器官中HO-1基因表达;进一步采用磁珠和流式分选小鼠脾脏DC细胞、T细胞、NK、巨噬细胞、粒细胞,RT-PCR检测两组小鼠不同免疫细胞中HO-1基因的表达。2.分选B6 WT小鼠脾脏来源的T细胞,使用10?g/mL ConA刺激T细胞活化。使用10ng/m L GM-CSF和10ng/m L IL-4培养BALB/c小鼠骨髓来源的DC细胞,使用10?g/m L LPS刺激DC细胞活化。采用RT-PCR方法分别检测T和DC活化前后HO-1基因的表达水平。3.使用10ng/m L GM-CSF和10ng/m L IL-4培养BALB/c小鼠骨髓来源的DC细胞,使用X-Ray辐照处理抑制其增殖。分选B6 WT和KO小鼠脾脏来源的T细胞,并使用CFSE进行标记。将2×104的DC细胞分别和WT和KO小鼠1×105的T细胞共培养,流式细胞术检测异基因活化的T细胞增殖。4.收集2例健康志愿者标本,分离外周血单个核细胞,一个作为效应细胞,另一个作为刺激细胞。X-ray照射抑制刺激细胞增殖,CFSE对效应细胞进行标记,将1×105的效应细胞和1×105的刺激细胞分别加入96孔板中,然后分别加入不同浓度的HO-1抑制剂ZNPP及HO-1激动剂COPP,混合培养72小时,采用流式细胞术检测T细胞增殖、活化和凋亡。同样的方法,把1例健康供者的细胞作刺激细胞,移植后4周发生和未发生a GVHD患者细胞作为效应细胞,然后分别加入不同浓度的HO-1抑制剂ZNPP及HO-1激动剂COPP,混合培养72小时,采用流式细胞术检测T细胞增殖。结果:1.异基因移植后小鼠HO-1基因表达水平明显低于同基因组,异基因移植组小鼠CD4+T细胞中HO-1表达下降最为明显。2.Con A刺激后,T细胞中HO-1的表达量显著降低,但LPS刺激并不能改变DC细胞中HO-1的表达量。3.在小鼠混合淋巴细胞反应中,HO-1基因敲除能够促进异基因活化的CD4+T细胞和CD8+T的增殖。4.HO-1抑制剂ZNPP能促进混合淋巴细胞反应中CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化和增殖。ZNPP能够抑制CD4+T和CD8+T细胞的凋亡。HO-1激动剂COPP能够抑制混合淋巴细胞反应中CD4+T细胞增殖,尤其是对没有发生a GVHD患者细胞的增殖抑制比较明显(P<0.05)。结论:与同基因移植组相比,异基因移植后小鼠a GVHD靶器官中HO-1基因表达显著降低。进一步免疫细胞亚群分析发现,异基因移植组小鼠CD4+T细胞中HO-1基因表达水平降低最为显著。与对照组相比,使用Con A刺激T细胞活化后HO-1基因表达显著降低。但LPS刺激对DC中HO-1的表达并没有影响。通过基因敲除以及使用HO-1抑制剂和激动剂发现,HO-1能够抑制异基因活化的T细胞反应。第三部分血红素加氧酶-1在急性移植物抗宿主病中的作用及机制研究目的:探究HO-1在小鼠allo-HSCT后a GVHD中的作用及其调节机制。方法:1.采用BALB/c(H2-Kd)小鼠作为受体鼠,HO-1敲基因小鼠(H2-Kb)和C57BL/6(H2-Kb)野生型小鼠作为供体鼠,建立供体敲基因小鼠a GVHD模型。受体鼠接受750c Gy全身性致死性辐照,4小时后通过尾静脉注射方法分别输注WT和HO-1 KO供体小鼠1×107的骨髓细胞和5×106的全脾细胞。2.使用HO-1敲基因小鼠(H2-Kb)和C57BL/6(H2-Kb)野生型小鼠作为受体,BALB/c(H2-Kd)小鼠作为供体,建立受体敲基因小鼠a GVHD模型。受体鼠接受900c Gy全身性致死性辐照,4小时后通过尾静脉注射方法分别输注供体小鼠1×107的骨髓细胞和1×107的全脾细胞。3.使用BALB/c(H2-Kd)小鼠作为受体鼠,接受750c Gy全身致死性辐照,4小时后通过尾静脉注射的方法输注CD45.1 C57BL/6(H2-Kb)小鼠来源的1×107骨髓细胞和CD45.2 C57BL/6(H2-Kb)小鼠或HO-1 KO(H2-Kb)小鼠1×106脾脏分选的T细胞,建立供体T细胞敲基因a GVHD模型。4.移植后观察两组小鼠生存和体重变化,记录GVHD积分,并对脾脏、肝脏、皮肤和小肠等各GVHD靶器官进行病理学分析。移植后第14天采用流式细胞术检测两组小鼠的脾脏、肝脏、肺和小肠四个脏器中的免疫细胞,包括T细胞、活化的T细胞、DC细胞、巨噬细胞、MDSC以及Treg细胞的数量,以及T细胞分泌细胞因子的水平。结果:1.在供体敲基因a GVHD小鼠移植模型中研究发现:HO-1基因敲除后能显著促进移植后a GVHD的发生发展:(1)显著促进小鼠a GVHD相关死亡;(2)加重a GVHD相关的体重减少;(3)显著增加病理评分。流式检测发现,HO-1敲基因供体组小鼠能促进靶器官中T细胞浸润以及T细胞的活化,促进干细胞的植入;HO-1敲基因供体组小鼠能促进GVHD靶器官中巨噬细胞、DC细胞的分布,并能促进DC细胞的活化,抑制Treg细胞在a GVHD靶器官中的浸润;此外,HO-1敲基因供体组小鼠血清和a GVHD靶器官中细胞因子水平也显著升高。2.在受体敲基因的小鼠a GVHD模型中研究发现:HO-1敲基因组小鼠加重a GVHD的发生发展。促进巨噬细胞、DC细胞、中性粒细胞在a GVHD靶器官中分布,促进T细胞的活化,抑制靶器官中Treg细胞的数量。3.在供体T细胞敲基因a GVHD小鼠移植模型中研究发现:与对照组相比,供体T细胞中HO-1基因敲除能促进CD4+和CD8+T细胞中炎症细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达。此外,T细胞的活化显著增高,Treg细胞显著减少。结论:供体与受体HO-1基因缺失都能够显著促进小鼠a GVHD的发生发展,促进巨噬细胞、DC细胞向各GVHD靶器官中浸润,促进T细胞、DC细胞的增殖与活化,抑制Treg细胞的增殖,从而加重a GVHD靶器官的损害。供体T细胞HO-1敲基因移植模型进一步证明,HO-1能够通过直接调控a GVHD中T细胞反应发挥作用。