心血管疾病已成为现代社会威胁人类健康的主要原因之一。随着生活方式、环境因素的改变,我国心血管疾病的发病率、死亡率居高不下,已超过恶性肿瘤并成为首要的致死原因,而血栓的形成是导致心血管疾病进展恶化的核心环节。血小板在血栓形成中发挥关键作用。动脉粥样硬化斑块破裂时,血小板通过表面受体与内皮下基质相互作用,启动活化信号。活化的血小板释放胞浆颗粒内容物,募集循环血液中的血小板及其他血液细胞,促进凝血通路活化。血小板表面活化的整合素α_IIbβ₃与纤维蛋白原（Fibrinogen）结合,介导血小板之间的紧密连接、血小板内部信号转导和骨架重排,最终形成血栓阻塞血管腔,引起组织、器官缺血,导致急性心肌梗死、缺血性脑卒中等危重疾病发生。血小板的促凝作用也参与了静脉血栓的形成,是促成脑栓塞、肺栓塞、肿瘤相关静脉血栓发病的重要因素之一。随着对血小板活化机制的研究深入,人们对抗血小板治疗在预防和控制血栓中的重要地位有了更进一步的理解。现有的抗血小板药物虽有助于减少血栓事件,但存在出血风险增加、疗效个体差异大等缺陷。目前,寻找安全、有效的新型抗血小板药物仍然是心血管研究领域的热点和重要研究方向。蛋白二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase,PDI）在血小板中表达,当血小板活化时释放至细胞膜表面并与整合素α_IIbβ₃结合,发挥还原酶作用催化整合素α_IIbβ₃中二硫键开放和构象活化,从而促进血小板活化和血栓形成,同时也能介导凝血因子活化、释放和凝血通路激活。鉴于细胞外PDI在血栓调控中的重要作用,抑制PDI有望提供一种全新的抗血栓治疗策略。流行病学研究表明,富含天然植物多酚的饮食有助于降低心血管事件风险。实验研究显示植物多酚提取物具有抗血小板活化的作用,但其中发挥保护作用的具体分子及机制尚不完全清楚。值得注意的是,植物多酚被发现是天然PDI抑制剂的重要来源。为了在植物多酚中进一步探索潜在的抗血小板药物,我们在本研究中选择与心血管保护相关的膳食多酚类物质构建化合物分子库,通过分子对接模拟筛选具有抑制PDI活性的抗血小板抗血栓天然化合物。分析结果显示单宁酸（Tannic acid,TA）与PDI分子的结合潜能最高。TA作为药物应用的历史悠久,具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等多种生物活性,但TA对PDI活性和血小板活化的作用目前尚不清楚。我们在本研究中明确了TA对PDI活性和血小板表面PDI功能的影响,研究了TA对血小板活化和血栓形成的作用和机制。目的:基于分子对接筛选,从植物多酚中寻找具有抑制PDI活性的抗血小板抗血栓天然化合物。研究方法:1.筛选具有抑制PDI活性的植物多酚及TA对PDI活性的影响。（1）分子对接筛选与模拟:为了从植物多酚中寻找一种具有抑制PDI活性的抗血小板抗血栓化合物,我们首先选择与心血管保护相关或日常膳食中含量丰富的多酚类物质构建化合物库,从有机小分子生物活性数据（Pub Chem）获得各个分子的二维结构,从蛋白质数据库（Protein Data Bank,PDB）获得氧化、还原状态的人PDI分子结构（氧化状态:4EL1、还原状态:4EKZ）,并通过高通量网络分子对接平台systems Dock（http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）分析植物多酚与PDI分子的结合能力,通过对结合分值的排序筛选出与PDI结合最强的分子（TA）,并分析PDI分子和TA的结合部位。在获得结合部位后,我们进一步运用Auto Dock Vina软件对TA与PDI分子结合的模式进行详细分析,探索两者结合的空间构象、氨基酸残基和分子间距离。（2）TA与PDI分子在体外的结合:我们通过表面等离子共振固液相芯片,采用Biacore T200系统实时分析流动相TA与固定相PDI蛋白的结合能力和模式。（3）PDI还原酶活性:我们在体外分别用TA或生理盐水（Normal saline,NS,对照溶剂）与重组人PDI共孵育,再检测PDI对荧光底物双曙红-氧化型谷胱甘肽（Di-eosin-glutathione disulfide,Di-E-GSSG）的还原能力,用酶标仪检测二硫键切割后增加的曙红荧光强度,反映PDI还原酶活性。同时采用胰岛素还原试剂盒检测PDI活性。2.研究TA对血小板表面PDI功能的影响。（1）血小板表面自由巯基形成:血小板活化释放的细胞外PDI将细胞膜表面底物蛋白分子中的二硫键还原,形成的自由巯基可用N-（3-马来酰亚胺丙酰基）生物胞素（3-（N-Maleimidopropionyl）-biocytin,MPB）标记检测。我们将用MPB标记TA或NS处理的人血小板,使用凝血酶（Thrombin）刺激血小板活化,用还原型谷胱甘肽中和剩余的MPB,用荧光素交联的链霉亲和素免疫印迹检测血小板膜表面自由巯基水平的变化。（2）PDI与血小板表面整合素α_IIbβ₃的结合:血小板活化过程中释放的PDI通过与整合素α_IIbβ₃结合停留在细胞膜表面并发挥调控作用。我们将利用Alexa Fluor-488荧光素交联的重组PDI与人血小板在离体环境中共同孵育,使用TA或NS预处理,加入锰离子（8m M）促进整合素α_IIbβ₃转变为活化构象,通过流式细胞技术检测血小板表面的荧光强度,分析结合在血小板表面的PDI水平。3.研究TA对血小板活化的影响。（1）血小板聚集:胶过滤分离人血小板,予TA或NS预处理,加入血小板刺激剂胶原（Collagen）或thrombin,磁力搅拌5分钟（Minutes,min）,用CHRONO-LOG血小板聚集仪测定透光度,记录聚集曲线,分析血小板聚集率的变化。（2）整合素α_IIbβ₃活化:PDI通过催化α_IIbβ₃转变为开放构象介导血小板活化和血栓形成。我们用TA或NS预处理人或小鼠血小板,thrombin或胶原相关肽（Collagen-related peptide,CRP）刺激血小板活化,用异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate,FITC）荧光交联的可溶性人fibrinogen、藻红蛋白（Phycoerythrin,PE）交联的小鼠活化整合素α_IIbβ₃抗体（JON/A）标记血小板表面活化状态的整合素α_IIbβ₃,用流式细胞仪分析血小板整合素α_IIbβ₃活化程度。（3）血小板α颗粒释放:分离人血小板,体外用TA或NS预处理10 min,用流式细胞仪检测血小板表面P-选择素（P-selectin）的表达,以明确TA对血小板α颗粒释放的影响。（4）TA对血小板活性氧族（Reactive oxygen species,ROS）生成的影响:TA或NS预处理人血小板,DCFDA孵育血小板,用CRP刺激,通过流式细胞仪检测DCF荧光强度,反映血小板内ROS水平。（5）血小板粘附:采用Bio Flux200?流动室系统,用,人全血用TA或NS处理、钙黄绿素-AM（Calcein-AM）标记,灌流通过I型collagen包被的通道,荧光显微镜记录分析粘附的血小板量。（6）血小板铺展:高亲和力的整合素α_IIbβ₃与配体fibrinogen结合激活血小板内下游信号,引起血小板完全活化和骨架变构。用TA或NS预处理分离的人血小板,观察其在fibrinogen包被表面的铺展面积,反映整合素“外向内”早期信号。（7）血块收缩:用TA或NS预处理人血小板,加入thrombin诱导血块形成,持续观察血块面积情况,比较血块收缩程度,反映TA对血小板“外向内”信号的影响。4.研究TA对动脉血栓形成的影响。（1）激光诱导提睾肌小动脉血栓:给予C57BL/6小鼠TA（5 mg/kg）或NS腹腔注射,循环30 min,麻醉后分离提睾肌小动脉,从颈静脉注入3,3’-二己氧基羰花青碘化物（3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide,DIOC6）荧光染料标记血液细胞。在活体血管成像荧光显微镜下观察定位到目标血管,用脉冲激光刺激血管壁,造成局部损伤形成急性动脉血栓,在显微镜下观察记录血栓形成的动态过程,分析血栓总面积、峰值。（2）小鼠剪尾出血时间:给予小鼠TA（5 mg/kg）或NS腹腔注射,循环45 min,麻醉后截去鼠尾末端5 mm,立即将残端放入37℃的NS中,从流血开始计时,记录开始出血至第一次出血停止的时间。（3）小鼠颈静脉出血时间:给予小鼠TA（5 mg/kg）或NS腹腔注射,循环30min,麻醉后暴露颈静脉,体视显微镜下观察,以28G注射针尖刺破一侧血管壁,记录出血开始至首次出血停止时间。（4）凝血功能检测:给予小鼠TA（5 mg/kg·d）或NS腹腔注射7天,采集静脉血,在自动凝血分析仪检测凝血酶原时间（Prothrombin time,PT）和活化部分凝血活酶时间（Activated partial thromboplastin time,APTT）。5.研究TA对血小板的潜在毒性及类药性。（1）TA对血小板活力的影响:抑制细胞内PDI可能导致内质网应激、ROS上调、细胞损伤甚至死亡。为了探索TA是否可能通过这一途径对血小板产生细胞毒性,我们使用Alamar Blue试剂检测TA或NS预处理后人血小板内线粒体功能的变化,评估其对细胞活力的影响。（2）TA对血小板凋亡的影响:通过FITC交联的膜联蛋白-V（Annexin V）检测血小板膜表面磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）,流式细胞术检测血小板荧光强度,评价TA对血小板凋亡的影响。（3）TA对血小板数的影响:给予小鼠TA（5 mg/kg·d）或NS腹腔注射7天,采血后用自动血细胞计数仪检测血小板数。（4）TA对缓冲液p H值的影响:使用台式p H计测定不同浓度TA-Tyrode’s buffer的p H值,与Tyrode’s buffer进行比较。（5）TA的类药性分析:使用SWISSADME网站（http://swissadme.ch/index.php）对TA分子结构进行类药性分析。结果:1.TA与PDI结合并抑制PDI还原酶活性。（1）TA与PDI相互作用:对42种植物多酚化合物与PDI蛋白的分子对接筛选显示:TA在对接化合物中与不同构象PDI分子的结合分值最高,空间构象显示TA与PDI的结合位置在a或a’结构域的活性位点附近。用Auto Dock Vina软件对TA与PDI分子a’结合位点的进一步分析显示TA与PDI分子a’结构域第400位半胱氨酸残基形成两个氢键连接,距离分别为1.492埃和2.797埃。（2）TA与PDI蛋白体外结合:Biacore仪器检测结果显示,流动相TA与固定相PDI蛋白分子高亲和力结合。（3）TA抑制PDI的还原酶活性:Di-E-GSSG和胰岛素还原实验结果显示TA与NS相比显著抑制PDI还原酶活性。2.TA抑制血小板表面PDI功能。（1）TA抑制血小板表面PDI还原酶功能:血小板活化时PDI释放至细胞膜表面,与底物蛋白结合,催化二硫键切割形成自由巯基。通过MPB标记血小板外自由巯基,显示TA与NS相比能明显抑制thrombin刺激诱导的血小板表面自由巯基生成。（2）TA抑制PDI与血小板整合素α_IIbβ₃的结合:释放至细胞外的PDI主要通过结合整合素α_IIbβ₃停留在血小板表面发挥功能。流式细胞实验显示TA（30μM）能够明显抑制Mn²⁺作用下重组PDI与开放的血小板表面整合素α_IIbβ₃的结合。3.TA抑制血小板活化。（1）TA抑制不同刺激剂诱导的血小板聚集:胶过滤分离的人血小板与TA孵育后,加入不同刺激剂,检测血小板聚集率,结果显示:TA与NS相比,剂量依赖性抑制collagen（2μg/m L）诱导的人血小板聚集,其半数抑制浓度为:34.9μM。TA也能抑制thrombin（0.05 U/m L）诱导的血小板聚集。（2）TA抑制血小板整合素α_IIbβ₃活化:血小板在刺激剂作用下启动细胞内信号,传递至整合素α_IIbβ₃,引起后者构象改变,在胞外PDI作用下达到最大活化状态。流式细胞实验结果显示:与NS相比,TA（50μM）预处理显著降低thrombin（0.1 U/m L）或CRP（1μg/m L）诱导的人血小板表面整合素α_IIbβ₃的活化。在小鼠血小板中的实验结果也证实了TA（30μM、50μM）对血小板表面整合素α_IIbβ₃的活化具有抑制作用。（3）TA抑制血小板P-selectin表达:血小板活化时释放胞浆α颗粒,释放至血小板表面的P-selectin水平可反映血小板活化程度。流式细胞分析显示:与NS相比,TA（10μM、30μM、50μM）预处理显著抑制thrombin（0.1 U/m L）或CRP（1μg/m L）诱导的血小板表面P-selectin表达上调。（4）TA抑制血小板氧化应激:血小板活化过程中,生成的ROS促进血小板活化。流式实验显示:TA（30μM、50μM）作为一种天然抗氧化剂,显著抑制CRP（1μg/m L）诱导的血小板ROS水平上调。（5）TA抑制血小板在collagen表面的粘附:血管壁暴露的collagen可激活血流中血小板,使其粘附于内皮受损部位。流体小室实验结果显示,TA与NS相比,显著减少了collagen表面上粘附血小板量。（6）TA抑制血小板在fibrinogen表面的铺展:整合素α_IIbβ₃与fibrinogen结合后向血小板内传递活化信号,引起细胞骨架变化。血小板铺展实验结果显示TA（10μM、30μM、50μM）预处理的血小板在fibrinogen表面的铺展面积明显小于对照组。（7）TA抑制血块收缩:整合素α_IIbβ₃传递的血小板“外向内”信号,在血小板活化终末阶段引起细胞骨架改变和血块收缩。实验结果显示:TA（30μM）与NS相比显著抑制thrombin（1 U/m L）诱导的血凝块收缩。4.TA抑制小鼠动脉血栓形成且不延长出血时间。（1）TA抑制小鼠提睾肌小动脉血栓形成:通过Intravital显微镜实时定量分析动脉血栓形成过程,结果显示:与NS相比,TA（5 mg/kg,腹腔注射）抑制小鼠提睾肌小动脉激光损伤诱导的血栓形成。定量分析显示TA组血栓总面积显著低于对照组。（2）TA不延长小鼠出血时间:我们测定了小鼠剪尾出血和针刺损伤颈静脉出血时间以评估TA对生理性止血的影响。结果显示TA（5 mg/kg,腹腔注射）组小鼠剪尾出血时间和颈静脉出血时间与对照组相比无显著延长。（3）TA不影响凝血功能:小鼠接受注射TA（5 mg/kg·d,腹腔注射）给药7天后,PT和APTT与对照组比较无显著差异。5.TA对血小板无毒性作用。（1）TA不影响血小板活性:Alamar Blue检测线粒体功能以评估细胞活力。通过酶标仪检测Alamar Blue荧光显示:与NS相比,与不同浓度TA（10μM、30μM、50μM、100μM）共同孵育4小时后,人血小板活力无显著下降。（2）TA不增加血小板凋亡:血小板发生凋亡时表面增加的PS可用Annexin V定量标记。流式细胞实验显示:TA（30μM、50μM、100μM）与NS相比不增加血小板表面Annexin V水平。（3）TA不影响血小板数:小鼠接受注射TA（5 mg/kg·d,腹腔注射）给药7天后,血小板数与对照组比较无显著差异。（4）TA不影响缓冲液p H值:使用p H计测定显示10μM、30μM、50μM、100μM的TA-Tyrode’s buffer溶液的p H值与Tyrode’s buffer无显著差异。（5）TA的类药性分析:SWISSADME平台预测显示,TA的生物有效性评分为0.17,Lipinski评分为3。结论:1.植物多酚TA与PDI分子高亲和力结合,分子对接的结合位点为a’结构域的第400位半胱氨酸。2.TA抑制PDI活性和PDI与整合素α_IIbβ₃的结合。3.TA抑制血小板活化和血栓形成。4.TA对血小板无毒性作用,且不延长出血时间,有望成为安全的抗血栓药物。