两株黄杆菌水解岩藻多糖途径研究

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岩藻多糖是一类含有岩藻糖的硫酸性海洋多糖,是褐藻细胞壁中主要多糖之一。岩藻多糖的结构比较复杂,会因褐藻的种类、采样季节和提取的方法等不同而有所差异。这导致了它比其它藻类多糖更难被微生物利用。海洋黄杆菌因含有大量的碳水化合物活性酶被认为是专门降解有机聚合物的异养菌。本课题组前期已分离几株对海藻多糖有较好利用能力的Tamlana属菌株。因此,本论文以Tamlana属菌株为研究对象,通过以岩藻多糖为唯一碳源实验得到能利用岩藻多糖的菌株,并通过HPLC-UV、GC-MS等技术初步鉴定了这两种岩藻多糖的单糖组成,生物信息学手段预测了这两株菌的岩藻糖苷酶特征,分子生物学技术验证了岩藻糖苷酶的功能,最终对水解岩藻多糖的途径进行了初步探索。主要获得了以下结果:(1)两种不同来源的岩藻多糖(F-B和F-M)通过HPLC-UV和GC-MS技术鉴定,发现它们都含有葡萄糖;其中,F-B还含有少量的鼠李糖,葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。F-M和F-B的糖醛酸含量分别为22.7%和4.6%。此外F-M和F-B都被硫酸基团修饰,其硫酸根含量分别为15.6%和16.1%。通过唯一碳源实验发现菌株S2-14和PT2-4可分别利用F-B和F-M。进一步对这两株菌的基因组信息进行分析,发现这两株菌与岩藻多糖水解相关的PULs只含有GH29A家族的岩藻糖苷酶,另外菌株PT2-4的PULs中还含有参与水解岩藻多糖的硫酸酯酶。(2)菌株S2-14中的岩藻糖苷酶通过RT-q PCR验证发现明显上调表达;进一步通过异源表达和功能验证发现岩藻糖苷酶(Fuc_2660、Fuc_2918和Fuc_3313)都能单独地将F-B中聚合度5以上(DP≥5)的岩藻多糖水解成低聚合度的岩藻寡糖;最终初步阐明了该菌株水解岩藻多糖F-B的途径。此外,菌株S2-14中的岩藻糖苷酶Fuc_2918对葡萄糖和岩藻糖有转糖基活性,而Fuc_3313对葡萄糖、半乳糖、甘露糖有转糖基活性。(3)菌株PT2-4的岩藻糖苷酶和硫酸酯酶通过异源表达和功能验证,发现岩藻糖苷酶Fuc_1662可以直接将岩藻多糖F-M水解成聚合度8以下(DP≤8)的岩藻寡糖;而岩藻糖苷酶Fuc_0050需经硫酸酯酶Sul_1665脱磺酸基团处理后才能将岩藻多糖F-M水解为岩藻寡糖(DP≤8)。最终初步阐明了菌株PT2-4水解岩藻多糖F-M的途径。本论文通过对两种岩藻多糖结构和两株黄杆菌利用岩藻多糖途径的初步研究,获得了不同功能的岩藻糖苷酶和不同聚合度的岩藻寡糖,为最终阐明岩藻多糖的水解途径和获得具有不同生物学活性的岩藻寡糖奠定基础。
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