【摘 要】
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外源雌激素作为最严重的环境内分泌干扰物（Endocrine disrupting compounds,EDCs）之一,其代谢过程受到研究人员的极大关注。然而,雌激素在革兰氏阳性菌中的降解途径并不明确,降解基因转录调控过程的背景也不清楚。红球菌在雌激素降解中发挥了重要作用。课题组前期分离到一株高效降解雌激素的红球菌P14,17β-雌二醇胁迫的P14转录组数据发现了一个上调表达的雌激素降解基因簇,包括
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（批准号:31770130、批准号:32000072）； 中国博士后科学基金项目 2020M682831；
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外源雌激素作为最严重的环境内分泌干扰物（Endocrine disrupting compounds,EDCs）之一,其代谢过程受到研究人员的极大关注。然而,雌激素在革兰氏阳性菌中的降解途径并不明确,降解基因转录调控过程的背景也不清楚。红球菌在雌激素降解中发挥了重要作用。课题组前期分离到一株高效降解雌激素的红球菌P14,17β-雌二醇胁迫的P14转录组数据发现了一个上调表达的雌激素降解基因簇,包括调控蛋白TetR和细胞色素P450（CYP123A9）。对调控基因和P450进行研究,探究红球菌代谢雌激素过程的功能基因CYP123A9的功能和调控。本实验主要结果如下:（1）P450、TetR基因克隆和异源表达。功能验证CYP123A9能够将雌酮和睾丸酮分别转化为16-羟基雌酮和6-羟基睾丸酮。且CYP123A9的Thr242作为关键结合位点影响雌酮和睾丸酮的降解。（2）RT-qPCR验证了tetR和cyp123A9能被共转录。P14体内验证tetR过表达使CYP123A9表达量显著上调。预测启动子区并在大肠杆菌体系中验证,采取不断截短启动子并检测报告基因表达强度筛选tetR结合的最适启动子。14个启动子中,启动子P12作为CYP123A9最优启动子,受tetR诱导并激活下游基因表达。（3）为验证TetR与启动子P12结合的具体位点,对一反向回文序列ACGG-N14-CCGT进行单点突变和对称点突变,检测荧光强度。发现单点碱基突变强烈影响报告基因e GFP转录水平,对称点突变不破坏反向回文结构则能够使荧光强度恢复至原来水平甚至更高。推测该反向回文序列是TetR结合的区域,且不要求碱基严格保守。（4）为进一步研究调控蛋白TetR与不同雌激素刺激下P14总蛋白的结合能力,重组表达TetR并亲和纯化不同污染物诱导的P14总蛋白。在pull down实验中,比较雌酮、17β-雌二醇和睾丸酮下TetR结合蛋白。发现17β-雌二醇胁迫下,能够诱导产生更多与TetR结合的蛋白,E1诱导次之,T几乎没有。经蛋白质谱鉴定,17β-雌二醇诱导下TetR结合的蛋白中包括rpoc编码的RNA聚合酶亚基β’。我们猜测,E2胁迫下产生了RNA聚合酶亚基,完整装配后聚集在雌激素降解基因簇附近,识别和结合到启动子区附近,完成下游基因cyp123A9的转录。本研究在初步探讨TetR介导的红球菌P14雌激素降解转录调控机制积累了资料,发现了TetR转录调控家族的的正向调控的新案例,在转录水平上为解决雌激素污染提供了新的思路。
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