背景多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄期妇女常见的一种内分泌代谢异常性疾病,以慢性无排卵、高雄激素血症和卵巢多囊样改变为主要特征。常见的临床表现有不孕、多毛、月经紊乱以及肥胖等,其远期并发症包括Ⅱ型糖尿病、心血管疾病等。PCOS妇女肥胖的发病率为47%,显著高于普通人群,且肥胖程度与胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)呈高度正相关。对肥胖型和非肥胖型PCOS妇女的比较研究发现,肥胖型较非肥胖型PCOS妇女存在更严重的代谢紊乱,肥胖加重了IR程度。阻断肥胖、IR,打破代谢间的恶性循环,对阻断PCOS进程、改善内分泌异常及恢复排卵具有重要意义。育龄期妇女卵泡在其发育过程中受多种激素的影响,使卵泡经历发育、成熟、最终排卵。每一月经周期只有一个卵泡成熟排卵,其余卵泡则在不同时期闭锁。大量研究表明卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡有关。在PCOS妇女中卵巢颗粒细胞凋亡明显增加。PDCD4(programed cell death 4)是近年来新发现的糖脂代谢相关基因和促凋亡调控基因,其基因缺失能够明显改善胰岛素敏感性,抑制肥胖症的发生,促进脂质代谢,抑制细胞凋亡。PDCD4在PCOS妇女体内是否存在着异常表达从而进一步导致其糖脂代谢紊乱、颗粒细胞凋亡增强,将有助于揭示PCOS代谢异常及卵泡发育障碍的发生机制,对明确PCOS的发生发展有着重要的临床意义。本研究拟通过测定肥胖型和非肥胖型PCOS妇女以及对照人群外周血PDCD4的表达特点,探讨PDCD4与PCOS妇女的体重指数(Body mass index,BMI)、胰岛素抵抗以及脂质代谢紊乱的相关性；通过研究PDCD4对PCOS妇女卵巢颗粒细胞凋亡的影响,探讨PCOS卵泡发育障碍的分子机制,为PCOS的促排卵治疗提供新的治疗思路；进一步观察应用二甲双胍改善代谢紊乱后PDCD4基因表达水平的变化,明确PDCD4与PCOS代谢异常的相关性,为阐明PCOS发生机制提供理论依据,为PCOS的个体化治疗提供实验依据。目的1.通过比较PDCD4在PCOS妇女以及对照人群中的表达状态,明确PDCD4在PCOS患者中的表达特点；2.分析PDCD4表达与PCOS妇女BMI、胰岛素抵抗以及脂代谢参数的相关性；应用二甲双胍改善胰岛素敏感性后检测PDCD4表达水平的变化,阐明PDCD4表达与PCOS内分泌代谢紊乱是否存在相关性；3.探讨PDCD4表达对PCOS妇女卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其作用机制。方法1.病例收集选取在山东大学附属生殖医院就诊的PCOS妇女77例,PCOS的诊断依据中国PCOS诊断标准；另选择月经周期正常、因输卵管因素或男方因素就诊的不孕妇女67例为对照组；所有研究对象排除Cushing综合征、甲状腺功能障碍、分泌雄激素肿瘤和Ⅰ型、ⅡI型糖尿病,入组前3个月均未接受过任何药物或手术治疗；根据BMI分别将PCOS妇女及其对照组分成肥胖亚组(≥25kg/m2)以及非肥胖亚组(<25kg/m2)。2.实时荧光定量Real time RT-PCR检测分离所有病例外周血单个核细胞,提取RNA,利用实时荧光定量Real time RT-PCR检测PCOS妇女及其对照组PDCD4 mRNA的表达情况。3.卵巢颗粒细胞分离在超声探头引导下,经阴道穿刺抽吸卵泡取卵,抽吸出的卵泡液在实体显微镜下找到卵冠丘复合物,将拣卵后的卵泡液迅速转移至实验室进行颗粒细胞的洗涤纯化。4. Small interfering RNA (SiRNA)转染设计PDCD4-SiRNA序列,利用脂质体转染分离纯化后的PCOS妇女卵巢颗粒细胞；同时应用与PDCD4序列非同源性序列作为PDCD4-SiRNA阴性对照。5.流式细胞术检测PCOS妇女及对照组卵巢颗粒细胞分离纯化后,立即用Annexin V-FITC和PI(propidium iodide)凋亡检测试剂盒染色,经流式细胞仪检测分析卵巢颗粒细胞凋亡率。6. TUNEL检测PCOS妇女卵巢颗粒细胞分离纯化后进行PDCD4-SiRNA转染,利用TUNEL凋亡检测试剂盒染色,经激光共聚焦显微镜观察PDCD4-SiRNA转染前后卵巢颗粒细胞凋亡变化情况。7. Western blot检测PCOS妇女卵巢颗粒细胞分离纯化后进行PDCD4-SiRNA转染,提取细胞蛋白测定蛋白浓度后依次行SDS-PAGE电泳,转膜,抗体结合,暗室显影,观察PDCD4-SiRNA转染前后卵巢颗粒细胞凋亡信号通路分子Bax和Bcl-2的表达变化情况。8.统计学分析所有数据均使用SPSS统计学软件包分析,计量资料以均数±标准差表示,计数资料以数值和百分比表示；统计分析采用单因素方差、t检验、Spearman相关以及多因素回归分析；所有假设检验均进行双侧检验,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果一、PDCD4在PCOS妇女与对照人群中的不同表达状态1.PCOS患者与对照组临床特点的比较PCOS患者雌二醇(E2)、总睾酮(TT)、黄体生成素(LH)、空腹胰岛素(Insulin 0)、口服葡萄糖两小时后胰岛素(Insulin 120)以及稳态模型评估胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)明显高于对照组,结果具有统计学差异(P<0.05)；PCOS妇女卵泡刺激素(FSH)明显低于对照组,结果具有统计学差异(P<0.05)；两组间年龄、BMI、甲状腺刺激素(TSH)、催乳素(PRL)、空腹血糖(Glucose0)、口服葡萄糖两小时后血糖(Glucose 120)、胰岛p细胞功能指数(HOMA-p),总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)没有统计学差异。2. PCOS妇女与对照组肥胖和非肥胖亚组临床特点的比较PCOS妇女肥胖亚组E2、TT, LH、Insulin 0、Insulin 120、Glucose 120以及HOMA-IR明显高于对照肥胖亚组,具有统计学差异(P<0.05);FSH明显低于对照组,结果具有统计学差异(P<0.05)；两亚组间年龄、BMI、TSH、 PRL、Glucose 0、HOMA-β、TC、TG、LDL和HDL没有统计学差异。PCOS妇女非肥胖亚组TSH、E2、TT以及LH明显高于对照非肥胖亚组,具有统计学差异(P<0.05);FSH明显低于对照组,结果具有统计学差异(P<0.05)；两亚组间年龄、BMI、PRL、Insulin 0、Insulin 120、Glucose 0、Glucose 120、 HOMA-IR、HOMA-β、TC、TG、LDL和HDL没有统计学差异。3. PCOS妇女与对照组间及其肥胖和非肥胖亚组间PDCD4表达的比较通过对PCOS妇女与对照组病例外周血单个核细胞(PBMCs)中PDCD4 mRNA实时荧光定量PCR检测分析发现,PDCD4在PCOS妇女中的表达高于对照组,结果具有统计学差异(P<0.05);PCOS妇女肥胖亚组PDCD4表达明显高于对照肥胖亚组,具有显著的统计学差异(P<0.01);PCOS妇女与对照非肥胖亚组间PDCD4表达没有统计学差异。二、PDCD4表达与PCOS妇女及其对照组糖脂代谢的相关性分析及其临床意义1.PDCD4表达与体重指数(BMI)的相关性PCOS妇女中PDCD4表达与BMI具有显著的相关性(r=0.52,P<0.0001),对于对照组PDCD4表达与BMI没有相关性。2. PDCD4表达与胰岛素抵抗的相关性PCOS妇女中PDCD4表达与Insulin 0、Insulin 120、Glucose 120、HOMA-IR和HOMA-β具有显著的相关性(r=0.34,0.31,0.29,0.36,0.25；P<0.01或者0.05)；对于对照组PDCD4表达与胰岛素抵抗指标没有任何相关性。针对IR的PCOS患者给予口服二甲双胍三个月治疗,通过对其PBMCs中PDCD4 mRNA实时荧光定量PCR检测发现,PDCD4在二甲双胍治疗后其表达明显降低,结果具有统计学差异(P<0.05)。3. PDCD4表达与脂代谢紊乱的相关性PCOS妇女中PDCD4表达与TG具有显著的正相关性(r=0.39；P<0.001),PDCD4表达与HDL具有显著的负相关性(r=-0.41；P<0.001),对于对照组PDCD4表达与脂代谢指标没有任何相关性。4. PDCD4表达与PCOS妇女发病风险的关联性分析通过多因素回归分析发现,校正E2和Insulin 120后,PDCD4表达对于PCOS妇女发病是独立的风险因素(相对危险系数,1.318；95%可信区间,1.021-1.703,P<0.05),表明PDCD4的高表达加重了PCOS的发生和发展,是反映PCOS妇女发病的重要危险因素。三、PDCD4表达对PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其作用机制1. PCOS妇女与对照组卵巢颗粒细胞凋亡的对比应用流式细胞术对23例PCOS妇女以及30例对照卵巢颗粒细胞检测发现,PCOS组卵巢颗粒细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。2. PDCD4表达沉默前后PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的对比为了进一步证实PDCD4对于卵巢颗粒细胞促凋亡作用,通过PDCD4-SiRNA转染卵巢颗粒细胞24h后发现其凋亡率明显降低(P<0.05),TUNEL分析也发现凋亡细胞数量明显减少。3. PDCD4表达沉默前后PCOS卵巢颗粒细胞凋亡通路信号分子表达变化为了确定PDCD4表达沉默对于凋亡通路关键信号分子的影响,通过Western blot发现,DCD4-SiRNA转染卵巢颗粒细胞24h后Bax表达明显降低,Bcl-2表达明显升高,Bax/Bcl-2比值明显降低。结论1. PDCD4在PCOS妇女中出现高表达,其中肥胖亚组PDCD4表达增强尤为显著。2. PDCD4在PCOS妇女中的高表达与其肥胖指数、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱密切相关,是PCOS妇女发病的独立风险因素。二甲双胍治疗后PDCD4表达降低。3. PDCD4高表达促进PCOS妇女卵巢颗粒细胞凋亡,其作用途径主要是通过Bax/Bcl-2凋亡信号通路。