体外破骨细胞的形成及功能变化受牵张应力的影响,且不同的施力大小及不同的作用时间对破骨细胞的形成及功能的影响是不同的。但到目前为止,有关牵张应力导致破骨细胞生物学行为变化的分子机制尚不清楚。通过差异蛋白质组研究可以识别参与细胞生命活动过程中的重要蛋白质,为深入探索其机制提供信息。因此,本课题应用细胞牵张应力培养模型,以蛋白质组学技术为平台,通过蛋白质双向凝胶电泳、蛋白质染色、肽质量指纹图谱分析,结合现代计算机信息学和计算机网络通讯技术,首次观察牵张应力在破骨细胞诱导形成第5d及第9d的蛋白质组变化情况,定量、定性分析其蛋白差异,进一步明确牵张应力在不同阶段通过那些关键蛋白质调控破骨细胞的形成及功能,寻找和发现新的关键因子,探讨牵张应力对破骨细胞形成及功能影响的分子机制,为牵张应力状态下的骨改建机理的更深入研究提供依据。研究目标:1.探索适合蛋白组学研究的骨髓破骨细胞培养方法;2.建立骨髓破骨细胞诱导分化早期、末期阶段的蛋白质双向凝胶电泳图谱;3.识别机械性牵张力作用下与骨髓破骨细胞诱导分化相关的差异蛋白质点;4.鉴定牵张应力在不同阶段通过那些关键蛋白质调控破骨细胞的形成。为牵张应力状态下骨改建机理的进一步深入研究奠定基础。研究内容:1.人骨髓破骨细胞的诱导培养及鉴定。2.体外牵张应力加载细胞培养体系的建立。3.不同时段牵张应力作用下,人骨髓诱导细胞蛋白质双向凝胶电泳图谱的建立。4.蛋白斑点的图像分析。通过对不同时段人骨髓诱导细胞以及不同时段牵张应力作用下人骨髓诱导细胞双向凝胶蛋白斑点的图像分析,比较牵张应力与非牵张应力条件下,不同时段骨髓诱导细胞的差异蛋白质点。5.双向电泳差异蛋白斑点的肽质量指纹分析。提取在牵张应力与非牵张应力条件下,不同时段骨髓诱导细胞明显差异蛋白质点的肽片断,测定肽质量指纹图谱。6.相关蛋白斑点的鉴定。通过蛋白质组数据库检索并结合差异蛋白质点的表观分子量进行综合分析,鉴定出与骨髓细胞诱导及牵张应力相关的蛋白质。7.从鉴定的蛋白质的功能信息推导骨髓破骨细胞诱导及牵张应力对骨髓破骨细胞形成及功能影响的分子机制。研究方法:1.采用GM-CSF诱导培养方法培养人骨髓破骨细胞;2.第四军医大学口腔医学院正畸科与医学电子工程系合作研制的多通道细胞牵张应力加载系统用于体外牵张力的加载;3.根据预实验及初步结果,选择破骨细胞聚集早期以及细胞成熟期两个时间点,即细胞培养第5d及第9d样本进行蛋白质双向凝胶电泳;4.使用基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱仪(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)分析肽质量指纹图谱(Peptide mapping fingerprint, PMF);5.通过蛋白质组数据库检索并结合差异蛋白质点的表观分子量进行综合分析,鉴定出与骨髓细胞诱导及牵张应力相关的蛋白质。结果:1.牵张力作用下的人骨髓破骨细胞培养第5d细胞开始大量聚集,第9d形成最为典型的破骨细胞,但数量开始减少;2.骨髓破骨细胞诱导分化各阶段的蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)结果显示,牵张力作用于破骨细胞的第5d,有13个蛋白点的表达存在明显差异,其中新增蛋白点1个,缺失7个,2个蛋白点表达发生明显上调,3个蛋白点发生明显下调;第9d显示有15个蛋白点的表达存在明显差异,其中新增蛋白点5个,缺失6个,1个蛋白点表达发生明显上调,3个蛋白点发生明显下调;3.通过对制备好的样品进行MALDI-TOF-MS分析,得到了其中10个蛋白点的肽质量指纹图谱;4.将得到肽质量指纹图谱的10个蛋白点进行分析,通过应用多个数据库检索和对比鉴定出4个蛋白质,分别是:Glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase、Actin-cytoplasmic 1、Alpha-enolase、Serine/threonine-protein phosphatase PP1。其余6个蛋白质斑点为未知蛋白。结论:1.利用GM-CSF诱导培养方法培养人骨髓破骨细胞可获得足够数量的破骨细胞用于蛋白组学研究;2.利用差异蛋白组学方法研究牵张力对破骨细胞的影响是可行的;3.通过本研究发现了牵张力作用下的28个蛋白差异点,为牵张应力状态下骨改建机理的进一步深入研究奠定基础。4.本实验鉴定出了与牵张应力相关的4个蛋白,并得到另外6个蛋白的肽质量指纹图谱,为其功能及机械应力生物信号转导机制的进一步研究提供新的实验依据。