动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是大部分心脑血管疾病的重要危险因素,动脉粥样硬化因理想的动物模型缺乏在一定程度上限制对其药物干预治疗和发病机制的研究,而兔子因其独有的特点使之成为研究动脉粥样硬化和高脂血症的最适合模型之一。据报道LDLR功能缺陷是引起高胆固醇血症及AS的主要原因之一,本研究运用CRISPR/Cas9基因编辑对新西兰大白兔基因组中与动脉粥样相关基因进行基因编辑,对低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)的基因外显子上的主要结构域进行了敲除,从而破坏了其功能。研究针对LDLR基因的第二外显子和第七外显子的启动子分别构建了两对CRISPR/Cas9表达质粒,通过加帽(ARCA)和加尾修饰后的sgRNA和Cas9 mRNA配对用来显微注射制备转基因兔。本研究一共超排34只供体兔子,获得了 804枚受精卵。其中注射LDLR靶位点Cas9 mRNA和sgRNA第二外显子(E2)的胚胎数目为116枚,移植胚胎110枚,胚胎存活率94.83%;新西兰兔受体移植6只,兔怀孕顺利分娩2只,怀孕率33.33%;共出生4只仔兔,全部死亡,成活率为0%。注射Cas9 mRNA和sgRNA第七外显子(E7)的胚胎数目为209枚,移植胚胎202枚,胚胎存活率96.65%;新西兰兔受体移植12只,兔怀孕顺利分娩6只,怀孕率50%;共出生14只仔兔,成活仔兔11只,成活率为78.5%。同时在E2和E7位点上注射Cas9 mRNA和sgRNA的胚胎数目为442枚,移植胚胎373枚,胚胎存活率84.39%;新西兰兔受体移植19只,兔怀孕顺利分娩11只,怀孕率57.90%;共出生19只仔兔,成活仔兔8只,成活率为42.11%。在饲养过程中因为温度、疾病等因素,活到成年并继续血脂检测实验转基因兔16只。本研究获得的16只仔兔基因组PCR产物测序结果显示LDLR的2个位点均出现不同程度的突变,T载体克隆检测结果表明第七外显子突变(E7)共获得的8只仔兔全部双等位基因突变,双等位基因突变率为100%.其中3只LDLR基因突变兔两条染色体突变状况完全相同,确定为纯合子,纯合子率为37.5%。送检检测结果表明第二外显子(E2)和第七外显子(E7)2个靶位点共同突变的活转基因兔8只,1只未突变,突变率为87.50%,剩余7只LDLR基因突变兔均为双等位基因突变。LDLR敲除兔子分别在第5周,10周,15周抽血,使用全自动生化分析仪检测兔血清CHOL、TG、LDL、HDLt水平,通过SPSS软件数据分析发现CHOL含量突变组是正常组的17倍,LDL含量突变组是正常组的12倍,TG含量突变组是正常组的3倍,HDL突变组是正常组的2倍,CHOL和LDL 2个指标与正常组比较P<0.01差异极显著,TG和HDL与正常组比较P<0.05差异显著,表明利用CRISPR/Cas9系统可成功构建高血脂模型。在表型分析血脂脂蛋白的分布情况,结果显示与野生型兔相比LDLR-/-兔Beta区染色较深,说明该样本中富集低密度脂蛋白。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)主要成分是血清载脂蛋白B,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)中主要成分是载脂蛋白AI,Westernbloting实验结果显示LDLR-/-apoB的含量远大于野生型。LDLR-/-兔血脂蛋白中apoA1的含量比野生型低,其两者的比值可反映出致动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化脂质颗粒的平衡。ApoB和ApoA Ⅰ含量从侧面也体现了 LDL-C和HDL-C的水平。苏丹红ⅣV脂质沉积图片软件测量正常组兔子整条血管面积24812,斑块面积413,斑块占血管面积比例1.66%。测量模型组兔子整条血管面积23701,斑块面积15604,斑块占血管面积比例65.83%。可见动脉粥样硬化病变区有大量红染脂滴,并且主要集中在增生的内膜,结果显示模型组LDLR-/-斑块形成明显。主动脉切片结果表明LDLR-/-兔的主动脉出现管腔狭窄,管腔内膜增厚,表面覆盖脂质斑块和大量的泡沫细胞,发生血管壁增厚现象。测量结果取均值得出突变兔血管梗塞比例73.48%。正常兔血管梗塞比例37.65%。研究表明模型突变兔斑块内阳性细胞积分光密度(IOD)值28498.0098及Area面积242558,计算得出MOD值0.1174894。测量正常变兔斑块内阳性细胞积分光密度(IOD)值6824.50049及Area面积217538,计算得出MOD值0.0314,突变组的巨噬细胞阳性率明显大于正常组(P<0.01)。综上所述,本课题研究利用Cas9基因编辑技术和sgRNA显微胞质注射兔受精卵,成功获得典型动脉粥样LDLR基因敲除兔。目前还未有获得LDLR基因敲除兔个体的相关报道。通过各个表型分析数据表明本研究制备的兔模型可产生明显的动脉粥样病理变化。同时本课题为以后血栓疾病的治疗和研究打下基础。