论文部分内容阅读
本研究分为三部分:
第一部分:反义脱氧寡核苷酸阻断NF-кB治疗胰腺癌的体外研究
目的:观察转染NF-кB p65亚基反义寡核苷酸对人胰腺癌PANC-1细胞增殖活性及侵袭转移能力的影响,探讨以NF-кB为靶点治疗胰腺癌的可行性。
方法:体外实验分为反义治疗组、空ASODN组、空脂质体组和空白对照组。设计合成p65 ASODN,5’端以羧基荧光素FAM标记,全程硫代化修饰,利用脂质体介导将其转染入反义治疗组PANC-1细胞内,用流式细胞仪检测转染效率,用EMSA-ELISA法检测NF-кB亚单位p65的DNA结合活性的改变,用RT-PCR分析p65、细胞周期素D1(cyclinD1)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA表达的变化。
结果:1、流式细胞仪检测结果表明,反义治疗组转染效率为94.75%,其它各组均低于1%。2、EMSA-ELISA结果显示,反义治疗组的p65 DNA结合活性明显低于空脂质体组和空白对照组(P<0.05)。3、RT-PCR结果显示,反义治疗组p65、cyclinD1和ICAM-1 mRNA的表达均显著下降。4、MTT检测结果显示,在转染后24小时、48小时和72小时反义治疗组吸光度(OD)值均降低(P<0.05),细胞增殖受到抑制,抑制作用在转染后48小时最为明显(P<0.01)。
结论:在脂质体介导下,NF-кB亚单位p65 ASODN可成功转染胰腺癌PANC-1细胞株,并能有效抑制PANC-1细胞p65基因的表达,降低NF-кB的DNA结合活性,从而减少cyclinD1及ICAM-1基因的表达,降低细胞增殖活性,减弱细胞侵袭转移能力。
第二部分:反义脱氧寡核苷酸阻断NF-кB治疗胰腺癌的体内研究
目的:观察NF-кB亚单位p65反义寡脱氧核苷酸针对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的抑制作用。
方法:体内实验分为反义治疗组、空脂质体组和空白对照组。采取人胰腺癌细胞株PANC-1接种裸鼠皮下成瘤,利用p65反义寡脱氧核苷酸注入裸鼠移植瘤内,观察肿瘤体积的变化,并计算抑瘤率,用RT-PCR分析p65、细胞周期素D1(cyclinD1)mRNA表达的变化,用Western蛋白印迹法检测移植瘤瘤体NF-кB蛋白表达情况。。
结果:1、肿瘤体积变化显示:反义治疗组肿瘤生长速度明显缓于空脂质体组及空白对照组(P<0.05)。反义治疗组抑瘤率亦明显高于空脂质体组及空白对照组(P<0.05)。而空脂质体组和空白对照组间无显著性差异。2、RT-PCR结果显示:反义治疗组p65和cyclinD1的表达均显著下降。3、Western-blot检测结果显示:反义治疗组p65蛋白表达量低于空脂质体组和空白对照组。
结论:体内实验表明反义寡脱氧核苷酸在裸鼠胰腺癌移植瘤模型中能够抑制NF-кB的蛋白表达、结合活性,亦成功减少P65、cyclinD1基因表达。对移植瘤的生长能够有效抑制。
第三部分:NF-кB与胰腺癌肿瘤血管新生的作用以及临床意义
目的:探讨NF-кB与胰腺癌肿瘤血管新生的作用以及临床意义。
方法:对40例胰腺癌的石蜡包埋标本作NF-кB、CD31免疫组织化学染色,镜下对NF-кB评分和CD31标记的肿瘤微血管密度(MVD)计数。
结果:NF-кB染色评分高的胰腺癌微血管密度(MVD)明显增加(P<0.01);肿瘤直径>3.0cm组NF-кB染色评分明显高于<3.0cm(P<0.01);出现脉管癌栓、转移及及TNMⅢ期者的NF-кB染色评分高(P<0.05)。术后生存期>1年与<1年者NF-кB评分无明显差异(P>0.05)。
结论:NF-кB与胰腺癌的肿瘤血管新生可能具有某些相关性。NF-кB有可能成为胰腺癌分化、浸润、转移分析的指标之一。