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背景与目的牙周炎是以菌斑生物膜为始动因素,多种因素共同作用引起的牙周组织慢性炎症反应。牙周炎的主要特征是牙周附着丧失,牙槽骨丧失,最终导致牙齿脱落。牙槽骨骨量的维持主要依赖成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收。目前,炎症状态下牙槽骨骨吸收机制研究较多,骨形成的机制少有人关注且机制尚不明确。研究表明,骨的生长和维持与成骨细胞的数量和活性密切相关。成骨细胞的数量不仅取决于增殖和分化,也取决于细胞死亡。焦亡是一种由Caspase酶介导的新型细胞程序性死亡。当病理因素或破坏性因素刺激细胞时,NLRP3炎症小体的激活可导致Caspase 1依赖的促炎因子IL-1β和IL-18的成熟与释放以及GSDMD介导的细胞裂解死亡。NLRP3作为细胞焦亡过程中重要的炎症小体与多种疾病的发生发展相关。因此我们推测牙周炎骨形成障碍的原因可能与NLLRP3及其介导的成骨细胞焦亡有关。此外,牙周炎期间由抗菌反应引起的活性氧（reactive oxygen species,ROS）增多可能是组织损伤的一个重要原因。据报道,NLRP3炎症小体可以被ROS等多种危险信号激活,牙周炎状态下增加的ROS是否参与NLRP3炎症小体激活导致的成骨细胞焦亡目前有待研究。综上,本研究旨在通过体内体外实验研究牙周炎导致的牙槽骨丧失与NLRP3炎症小体激活导致的成骨细胞焦亡的相关性,阐明牙周炎状态下ROS激活的焦亡关键因子NLRP3与成骨功能障碍之间的关系及相关机制,从而揭示牙周炎牙槽骨丧失的新机制,为牙周炎的治疗提供有前景的治疗新策略。材料与方法1、探究牙周炎对成骨细胞焦亡及成骨功能的影响采用丝线结扎以及Pg-LPS注射构建小鼠牙周炎模型,通过Micro-CT扫描及苏木素-伊红染色评价小鼠牙槽骨丧失情况;采用免疫组织化学染色检测成骨相关因子以及Caspase 1、IL-1β的表达变化。采用Pg-LPS刺激体外模拟牙周炎环境,0.5、1、2、5 μg/mL Pg-LPS作用于成骨细胞3、6、12、24、48h后,CCK8检测细胞活力,LDH检测乳酸脱氢酶释放,qRT-PCR技术检测焦亡相关因子基因表达变化,Western Blot、细胞免疫荧光观察焦亡相关因子蛋白表达变化,Elisa检测细胞上清液中IL-1β和IL-18的浓度。划痕实验评价成骨细胞迁移,qRT-PCR、Western Blot检测成骨相关因子基因和蛋白表达情况,ALP染色观察成骨细胞早期分化能力,茜素红染色评价晚期矿化能力。2、评价牙周炎来源的ROS对细胞焦亡及成骨功能的影响采用ROS检测、过氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）活性检测以及谷胱甘肽抗氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH）活性检测观察Pg-LPS刺激后细胞内氧化应激变化。H2O2刺激构建氧化应激模型,CCK8检测细胞活力,LDH检测乳酸脱氢酶释放,qRT-PCR、Western Blot和细胞免疫荧光评价焦亡相关因子基因和蛋白表达变化,Elisa检测细胞上清液中IL-1β和IL-18的释放。细胞划痕实验、qRT-PCR、Western Blot、ALP染色、茜素红染色检测成骨功能改变。使用N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）清除细胞内ROS后,再次检测成骨细胞焦亡以及成骨功能变化相关指标。3、阐明牙周炎状态下焦亡关键因子NLRP3调控成骨功能的作用及相关机制采用MCC950抑制NLRP3后,体内体外实验评价NLRP3对成骨功能的作用。将小鼠分为对照组、牙周炎组、牙周炎+MCC950组,再次构建小鼠牙周炎模型,采用Micro-CT扫描、苏木素-伊红染色评价小鼠牙槽骨丧失情况,免疫组化染色观察ALP、OCN、Caspase 1、IL-1β的表达变化。将细胞分为Con组、Pg-LPS组、Pg-LPS+MCC950组。划痕实验检测成骨细胞迁移,qRT-PCR、Western Blot检测成骨相关因子基因和蛋白表达情况,ALP染色观察成骨细胞早期分化能力,茜素红染色评价晚期矿化能力。通过qRT-PCR技术检测NLRP3、Caspase1、GSDMD基因表达,筛选合适的NLRP3激活剂Nigericin的浓度,添加GSK-3β/β-catenin通路激活剂LiCl,将细胞分为4 组,Con 组、Pg-LPS 组、Pg-LPS+Nigericin 组、Pg-LPS+Nigericin+LiCl 组,qRT-PCR、Western Blot检测成骨相关因子基因和蛋白表达情况。通过使用NLRP3抑制剂MCC950以及GSK-3β/β-catenin通路抑制剂XAV-939,将细胞分为4组,Con组,Pg-LPS组,Pg-LPS+MCC950 组,Pg-LPS+MCC950+XAV-939 组,qRT-PCR、Western Blot 检测成骨相关因子基因和蛋白表达情况。结果1、牙周炎导致成骨细胞焦亡以及成骨功能障碍小鼠牙周炎导致牙槽骨丧失,成骨细胞表达更多的Caspase 1和IL-1β,成骨相关蛋白ALP、OCN表达减少。体外Pg-LPS刺激后成骨细胞活力降低、乳酸脱氢酶释放增加、焦亡相关因子NLRP3、Caspase1和GSDMD基因表达增加,NLRP3、GSDMD-N、Cleaved-caspase 1蛋白表达增加,细胞上清液中IL-1β和IL-18的释放增多,成骨相关因子基因和蛋白表达减少,成骨细胞迁移障碍、早期分化能力以及晚期矿化功能受损。2、牙周炎来源的ROS激活NLRP3导致成骨细胞焦亡及成骨功能障碍Pg-LPS刺激导致成骨细胞内ROS增多,过氧化物歧化酶活性以及谷胱甘肽抗氧化物酶活性降低。H2O2刺激导致细胞活力下降,乳酸脱氢酶释放增加,焦亡相关因子NLRP3、Caspase1和GSDMD基因表达增加,NLRP3、GSDMD-N、Cleaved-caspase 1蛋白表达增加,细胞上清液中IL-1β和IL-18的释放增多,成骨相关因子基因和蛋白表达减少,成骨细胞迁移障碍、早期分化能力以及晚期矿化功能受损。NAC抑制成骨细胞内ROS后,细胞焦亡减少,成骨功能障碍得到缓解。3、NLRP3通过抑制GSK3β/β-catenin通路导致成骨细胞功能障碍MCC950在小鼠体内减少了牙周炎导致的牙槽骨降低,抑制Caspase 1和IL-1β蛋白表达,促进成骨相关因子ALP和OCN蛋白表达。在体外,MCC950抑制NLRP3后,细胞迁移障碍得到改善,成骨相关因子的基因和蛋白表达增多,p-GSK3β、β-catenin的蛋白表达也增加。Nigericin激活NLRP3后,p-GSK-3β、β-catenin蛋白表达进一步降低,成骨相关因子基因和蛋白表达明显下降,GSK-3β/β-catenin通路激活剂LiCl却显著促进成骨相关因子基因和蛋白表达。GSK-3β/β-catenin通路抑制剂XAV-939降低MCC950导致的成骨相关因子基因和蛋白表达的升高。结论1、牙周炎导致成骨细胞焦亡以及成骨功能障碍。2、牙周炎来源的ROS参与NLRP3激活导致的细胞焦亡及成骨功能障碍。3、牙周炎状态下,NLRP3通过抑制GSK3β/β-catenin信号通路导致成骨细胞功能障碍。