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H5N1亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIVs）的自然宿主主要是野生水禽。但是,病毒有时会感染其他宿主,包括野生鸟类、陆生家禽及哺乳动物。同时H5N1亚型AIVs也给公共卫生安全带来严重威胁,主要侵害宿主呼吸系统,严重感染者常并发急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）和多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）。尽管目前已经广泛研究了 H5N1亚型AIVs的致病机理,但其致病的分子机制仍需继续探索,尤其是从病毒与宿主互作角度。目前大部分对于病毒与宿主之间相互作用的研究主要集中在蛋白水平。然而,绝大多数哺乳动物基因组被转录成非编码RNA（ncRNA）,其中包括长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）。lncRNA 通常应长度大于 200 个核苷酸的ncRNA,最初其被认为是基因组中不具有生物学功能的“转录噪音”。但是随着高通量测序技术的发展,越来越多的lncRNA被鉴定出来,为lncRNA功能研究奠定了基础。lncRNA的表达具有组织特异性和时空特异性,其一级序列保守性低,在表观遗传学、转录水平及转录后修饰等多层面调控基因表达。近年来,研究发现lncRNA在病毒复制和机体抗病毒免疫等方面发挥重要作用,并且可通过调节炎性细胞分化、迁移、活化以及炎症介质的产生等方式参与调控宿主天然免疫应答。因此,系统探究lncRNA在高致病性H5N1亚型AIVs中的潜在作用,能为深入了解其致病机理奠定基础,也为防控与治疗提供潜在的抗病毒靶点。1.LncRNA#61、LncRNA#45对流感病毒复制的影响为了探索lncRNA在H5N1亚型AIVs感染中的潜在作用,前期实验室通过RNA-Seq系统比较了一对对小鼠致病性差异显著的模式病毒（CK10和GS10）感染小鼠肺脏的差异lncRNA表达谱,筛选出了两个差异表达的潜在功能性lncRNA:NONMMUT011061（LncRNA#61）和 NONMMUT061245（LncRNA#45）。本研究进一步系统探索了 LncRNA#61、LncRNA#45对H5N1亚型AIVs复制的影响。通过qRT-PCR检测H5N1亚型AIVs CK10株感染6TN细胞后LncRNA#61、LncRNA#45的表达水平,发现病毒感染24 h后,LncRNA#61和LncRNA#45表达显著上调。随后探究了 LncRNA#61、LncRNA#45的表达规律,发现LncRNA#61、LncRNA#45可被多种亚型流感病毒显著诱导上调表达,包括H1N1亚型IAVs（PR8）以及H7N9亚型AIVs（S8）。通过RNA原位杂交技术（RNA-FISH）检测 LncRNA#61、LncRNA#45 的亚细胞定位,发现 LncRNA#61、LncRNA#45 主要定位在细胞核中,但在CK10病毒感染后会从细胞核转移至细胞质。综上所述,LncRNA#61、LncRNA#45能被多种亚型IAVs诱导上调,并在病毒感染后从胞核转移至胞质,提示其可能在病毒感染过程中发挥重要的作用。流感病毒在宿主细胞核中完成复制,且需劫持宿主细胞核内复制系统以达到最优化的感染状态。病毒核糖核蛋白复合体（Ribonucleoprotein complex,RNP）进入细胞核对于病毒挟持宿主细胞复制系统以及后期病毒进行复制是必需的。为了确实LncRNA#61、LncRNA#45对H5N1亚型AIVs复制的影响,通过过表达LncRNA#61、LncRNA#45,基于间接免疫荧光和双荧光素酶报告系统等实验技术,发现LncRNA#61、LncRNA#45显著抑制病毒NP蛋白表达、病毒聚合酶活性、病毒NP蛋白的mRNA、cRNA和vRNA合成以及病毒滴度。相反,通过siRNA干扰敲低LncRNA#61、LncRNA#45的表达,发现病毒复制效率显著上升。另外,值得注意的是LncRNA#61、LncRNA#45不仅显著抑制H5N1亚型AIVs的复制,还抑制其他亚型流感病毒的复制,包括H1N1亚型IAVs（PR8）和H7N9亚型AIVs（S8）,表明 LncRNA#61、LncRNA#45 广泛抑制 IAVs 的复制。此外,LncRNA#61、LncRNA#45还显著抑制病毒诱导的细胞凋亡。综上所述,本研究发现LncRNA#61、LncRNA#45发挥广谱抗流感病毒作用。2.LncRNA#61、LncRNA#45抗病毒复制的分子机制上述结果确实了 LncRNA#61、LncRNA#45对流感病毒的复制具有抑制作用。为了进一步探究LncRNA#61、LncRNA#45对病毒单轮复制的影响,通过qRT-PCR检测单轮复制时间点NP基因表达水平,结果发现LncRNA#61、LncRNA#45显著抑制病毒进入、病毒早期和中后期复制阶段。随后为了进一步探究LncRNA#61、LncRNA#45抑制病毒复制的分子机制,通过间接免疫荧光试验观察病毒聚合酶成分NP及PA蛋白的核聚集情况,结果发现LncRNA#61、LncRNA#45显著抑制CK10病毒NP及PA蛋白的核聚集能力。然而,随后通过透射电镜试验发现LncRNA#61、LncRNA#45对病毒粒子释放时的形态变化没有影响。因此,初步推测LncRNA#61、LncRNA#45可能通过抑制聚合酶活性以及病毒NP和PA蛋白核聚集能力进而抑制病毒复制。随着更多lncRNA生物学功能的发现,其二级和三级结构受到越来越多的关注。为进一步探究LncRNA#61、LncRNA#45抗流感病毒发挥作用的关键功能区,通过RNAfold软件预测其二级结构,并成功构建了一系列截短突变体。通过qRT-PCR检测突变体对病毒NP基因mRNA水平的影响,发现LncRNA#45基序中除了 LncRNA#45-MutF（580bp-730bp）和 LncRNA#45-MutI（1200bp-1310bp）外,其他基序均显著抑制病毒NP基因的mRNA水平;同时发现,LncRNA#61-MutB、LncRNA#61-MutC、LncRNA#61-MutE 及 LncRNA#61-MutI显著抑制病毒NP基因的mRNA水平和病毒聚合酶活性。随后,进一步探索了LncRNA#61 的抗病毒机制,发现 LncRNA#61-MutA、LncRNA#61-MutB、LncRNA#61-MutC、LncRNA#61-MutD、LncRNA#61-MutE和 LncRNA#61-MutG显著抑制NP及PA蛋白的核聚集。因此,以上研究结果表明,对于LncRNA#45,除了 LncRNA#45-MutF及LncRNA#45-MutI对应的二级结构域以外,其他区域均为LncRNA#45发挥抗病毒作用的关键区域;而对于LncRNA#61,LncRNA#61-MutB、LncRNA#61-MutC、LncRNA#61-MutE和 LncRNA#61-MutI对应的二级结构域为LncRNA#61发挥抗病毒作用的关键功能区。总之,本研究发现LncRNA#61、LncRNA#45能被多种亚型流感病毒显著诱导表达,并发挥广谱抗病毒作用。更重要的是,LncRNA#61、LncRNA#45作为一种广谱抗病毒因子,可能通过多个二级结构域抑制病毒聚合酶活性以及病毒NP和PA蛋白的核积累来抑制流感病毒的复制。继续探索LncRNA#61和LncRNA#45的抗病毒机制将有助于我们对于流感病毒致病机理的理解以及为加速抗病毒药物的研发提供新思路。