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重金属镉是环境中广泛分布的污染物,镉通过食物链和呼吸道进入机体,在体内多个器官蓄积。肝脏是镉蓄积的重要靶器官之一。miR-155与酒精性、药物性和炎症性肝病有关。研究表明,低氧条件下miR-155能通过靶向Rheb和Rictor来调节自噬。本实验室前期研究表明,镉通过下调BRL3A细胞中mTOR信号通路,诱导自噬水平上升,但其内在机制有待进一步研究。本研究以SD大鼠及大鼠肝细胞系BRL 3A细胞为研究对象,通过醋酸镉处理大鼠和细胞,利用细胞分子生物学相关方法,探究miR-155及其靶基因Rheb在镉致大鼠肝脏自噬中的作用机制,为进一步揭示镉致肝脏损伤的发病机制和防治措施提供理论依据。1.镉致大鼠肝脏自噬过程中对miR-155及其靶基因Rheb的影响将18只SD雄性大鼠随机分为两组,分别为对照组和染镉组。镉组大鼠自由饮用镉水（50 mg/L）90天。试验结束后,剖杀采集肝脏、尿液、全血和血清进行后续试验。测定肝脏系数;血液生化仪检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）活性;HE染色观察肝组织病理学变化;透射电镜观察超微结构;比色法检测肝组织中丙二醛（MDA）、还原性谷胱甘肽（GSH）的含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性;免疫组化观察LC3表达;QRT-PCR检测肝脏中miR-155及Rheb的表达水平;Western blot检测肝脏中自噬相关蛋白和Rheb/mTOR通路相关蛋白的表达量。结果显示:①与对照组相比,染镉组大鼠肝脏系数极显著下降（P<0.01）,大鼠血清中AST与ALP含量显著升高（P<0.05）;②HE染色结果表明镉暴露组大鼠肝小叶界限不清,透射电镜结果显示镉组肝脏细胞核染色质收缩,细胞核固缩浓染,线粒体嵴模糊断裂甚至崩解,自噬体生成增加;③肝脏中SOD活性显著降低（P<0.05）,CAT、GSH-Px活性极显著升高（P<0.01）,MDA、GSH含量极显著升高;④免疫组化结果显示镉组大鼠肝脏中LC3表达量增加;⑤镉组大鼠肝脏miR-155表达量极显著高于对照组（P<0.01）,Rheb基因表达水平显著降低（P<0.05）;⑥染镉组肝脏中自噬相关蛋白ATG5、Beclin1、LC3表达量均极显著增加（P<0.01）,Rheb、p-mTOR/mTOR表达量显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）。结果表明,镉暴露可引起大鼠肝脏发生毒性损伤;镉能上调大鼠肝脏中miR-155的表达水平,下调Rheb/mTOR通路蛋白表达水平,诱导大鼠肝脏自噬水平上升。2.miR-155及其靶基因Rheb在镉致大鼠肝细胞自噬中的作用机制体外培养BRL 3A细胞,经不同处理,分为对照组和镉组（5 μM CdAc2）;或NC-mimics 组和 miR-155 mimics（50 nM）组;或 NC-inhibitor 组、miR-155 inhibitor（200 nM）组、镉组、镉+inhibitor 组;或 NC-siRheb 组、siRheb（100 nM）组。CCK-8 法检测细胞活力,免疫荧光观察LC3聚点变化,透射电镜观察细胞超微结构,QRT-PCR检测miR-155、Rheb基因表达水平,Western blot检测自噬相关蛋白、Rheb/mTOR通路蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因法检测miR-155与Rheb间的作用。结果显示:①与对照组相比,5 μM Cd处理细胞6 h后miR-155表达水平极显著升高（P<0.01）,Rheb基因表达水平显著降低（P<0.05）,蛋白表达量极显著降低（P<0.01）,p-mTOR/mTOR比值显著降低（P<0.05）,自噬相关蛋白ATG5、Beclin1、LC3表达量均极显著增加（P<0.01）;②与NC-mimics组相比,50 nM miR-155 mimics转染细胞24 h后,细胞活力显著下降（P<0.05）,miR-155的表达水平极显著增加（P<0.01）,Rheb转录水平显著降低（P<0.05）,蛋白表达量极显著降低（P<0.01）,p-mTOR/mTOR比值显著减少（P<0.05）,自噬相关蛋白表达量均极显著增加（P<0.01）,LC3聚点增多,自噬体生成增加;③与NC-inhibitor组相比,200 nM miR-155 inhibitor转染细胞24h后,细胞活力无显著变化,Rheb蛋白表达水平极显著增加（P<0.01）,p-mTOR/mTOR比值极显著增加（P<0.01）;④与镉组相比,镉+inhibitor组细胞活力显著增加（P<0.05）,Rheb表达水平极显著增加（P<0.01）,p-mTOR/mTOR比值显著增加（P<0.05）,自噬相关蛋白表达量显著或极显著下降（P<0.05或P<0.01）,LC3聚点减少,自噬体生成减少;⑤野生组细胞转染miR-155 mimics后荧光比例比NC组极显著减少（P<0.01）;⑥与 NC-siRheb 组相比,100 nMsiRheb 转染细胞 24 h 后,Rheb 和 p-mTOR/mTOR 蛋白表达量极显著降低（P<0.01）,自噬相关蛋白表达量显著或极显著增加（P<0.05或P<0.01）。结果表明,镉能上调BRL 3A细胞中miR-155的表达水平,下调Rheb/mTOR通路蛋白表达水平,使自噬水平上升;miR-155对Rheb基因具有靶向负调控作用。全文结论:镉能引起大鼠肝脏发生毒性损伤,且能引起大鼠肝脏中miR-155表达水平上升,下调Rheb/mTOR通路,诱导自噬水平上升。Rheb是miR-155的直接靶点,miR-155能负调控Rheb的表达水平。