【摘 要】
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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是葡萄球菌属革兰氏阳性球菌,在哺乳动物中的传播范围较广,可引起奶牛乳房炎、败血症等一系列疾病。随着抗生素的滥用,越来越多耐药菌开始出现,结果导致奶牛乳房炎临床治疗越来越困难,所以研发新的杀菌生物制剂变得极为重要。噬菌体是一种以细菌为宿主的病毒,能与细菌的细胞壁结合后将遗传物质注入宿主内并在宿主菌内不断繁殖,最终杀死宿主菌
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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是葡萄球菌属革兰氏阳性球菌,在哺乳动物中的传播范围较广,可引起奶牛乳房炎、败血症等一系列疾病。随着抗生素的滥用,越来越多耐药菌开始出现,结果导致奶牛乳房炎临床治疗越来越困难,所以研发新的杀菌生物制剂变得极为重要。噬菌体是一种以细菌为宿主的病毒,能与细菌的细胞壁结合后将遗传物质注入宿主内并在宿主菌内不断繁殖,最终杀死宿主菌释放出子代噬菌体。裂解酶是由噬菌体感染后期表达的一类对细菌细胞壁肽聚糖具有水解作用的酶,具有宿主特异性、微量高效、不易使菌群产生耐药性、较为安全等优点,可通过原核或真核大量表达且技术成熟。本研究从来自某牛场的混合污水样中采用富集法成功分离提取到一株金黄色葡萄球菌噬菌体Sau-p573,通过电镜图片可观察到其具头部为噬菌体典型的二十面体头部,有不可收缩的长尾,为长尾病毒科噬菌体。通过双层平板法测得其最高效价位7×1010 PFU/m L,最佳感染复数为10。从一步生长曲线得知Sau-p573潜伏期为90 min,在3 h时到达平台期。使用实验室保存的金黄色葡萄球菌对其宿主谱进行测定,发现其对7株金黄色葡萄球菌具有裂解作用。对Sau-p573进行全基因组测序,经过NR数据库分析比对得知其ORF48为裂解酶蛋白。为了使裂解酶可溶性表达,在裂解酶序列N端插入MBP标签,构建表达载体p MBP2-Lys ZB48,IPTG诱导表达后得到的产物经SDS-PAGE分析后得知裂解酶为可溶性表达。研究通过细菌裂解后的浊度下降试验测得Lys ZB48在浓度为25～200μg/m L浓度区间具有裂解效果,随浓度上升裂解效果增加。通过平板计数测得宿主菌浓度为3×10~8时浓度为200μg/m L的Lys ZB48可在1 h使S.aureus 573下降2.1 lg CFU/m L。使用实验室保存的39株S.aureus以及7株E.coli对Lys ZB48的裂解谱进行了测定,发现Lys ZB48对其中的26株S.aureus以及4株E.coli具有裂解效果。研究测试了不同条件对Lys ZB48裂解效果的影响,通过试验结果分析得到Lys ZB48在4℃～42℃,p H为6～9具有一定活性,在37℃～42℃,p H 8～9范围内裂解效果最好,将Lys ZB48在37℃条件下孵育3 h测得裂解活性几乎全部消失。牛血清与不同浓度的奶粉会对Lys ZB48裂解效果的影响,与PBS对照组中Lys ZB48使宿主菌浓度下降2.2 lg CFU/m L相比,牛血清中Lys ZB48可使宿主菌浓度下降1.74 lg CFU/m L,含4%奶粉的Lys ZB48可使宿主菌浓度下降1.7 lg CFU/m L,裂解效果随奶粉溶液浓度的升高而逐渐下降,证明血清和牛奶中的一些组分相关抑制了裂解酶的裂解活性。此外,试验结果表明Lys ZB48在一定浓度下对生物膜具有清除效果,因此Lys ZB48在应用方面具有较大潜力。
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