论文部分内容阅读
胚胎干细胞(embryomc stem cell，ES细胞)的发现为生物学及医学研究开辟了一个新的研究领域，被Science评为1999年度自然科学十大进展之首，其在体外稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特点决定了其巨大的研究价值。本实验通过对三种饲养层细胞的分离培养，提供了几种简单有效的饲养层制备方法和适合KM mES细胞分离培养的体系。探讨KM mES细胞的培养液以及消化液浓度，获得一定代数的KM mES细胞集落，并对所得ES集落进行了鉴定。对ES细胞的分离培养和进一步研究有一定的指导意义。
本实验分两部分：饲养层制备以及KM mES细胞的分离培养及鉴定。饲养层包括MEF饲养层、mBMSCs饲养层和bBMSCs饲养层。对三种饲养层细胞采取两种不同的消化方式，一种是胰酶消化后，离心接种：第二种是胰酶消化后，当细胞收缩变圆，将要浮起时吸出消化液，用培养液洗涤后，制成细胞悬液，接种。
采用了饲养层与LIF及insulin联合使用，来分离小鼠ES细胞。将3.5～4d的胚胎直接培养在培养体系中，使ICM自然孵化，来分离培养KMmES细胞。选择MEF作饲养层，比较了不同级别(A级、B级)的桑椹胚、早期囊胚、扩张囊胚分离培养KM mES细胞的效果；比较了三种消化液浓度(0.25％胰酶-0.05％EDTA、0.20％胰酶-0.04％EDTA和0.05％胰酶-0.008％EDTA)对ES细胞分离培养的影响；探讨了添加LIF和添加insulin对ES细胞分离筛选效果的影响。并对分离筛选的ES细胞集落进行碱性磷酸酶(AKP)检测，核型分析和体外分化潜能的检验。
结果表明：
1、本实验改进的细胞培养法和饲养层制备方法，分离培养得到纯化的3种细胞及3种细胞的饲养层，用于分离培养ES细胞。3种细胞制备的饲养层均适合分离KMmES细胞。
2、LIF、 insulin和饲养层联合使用，从增殖5d的ICM分离出KM mES细胞，传至第5代，所得ES集落AKP检测结果阳性；核型分析结果为XY型；所得集落具有多向分化潜能。
3、实验得出ES细胞最佳消化液为0.05％胰酶-0.008％EDTA，ES细胞传代数最高，所得集落的阳性率也高于其它两消化液组，且差异显著(p<0.05)。
4、在本实验室条件下，得到KM mES细胞最佳培养基(H-DMEM+15％FBS+1％非必须氨基酸+1000IU/mLLIF+0.1mmol/L 2-巯基乙醇+0.1mmol/LI/T/S+20μg/mL胰岛素+1000IU/mL双抗+5.6mg/L两性霉素B)。
5、不同阶段、不同等级胚胎对ES细胞分离有很大的影响，扩张囊胚的孵化率最高并与桑椹胚和早期囊胚的孵化率分别比较，结果差异显著(p<0.05)，早期囊胚与桑椹胚的孵化率相比较结果差异不显著(p>0.05)；扩张囊胚、早期囊胚的贴壁率和P2代ES细胞集落形成率都要高于桑椹胚，而且比较结果差异显著(p<0.05)，早期囊胚和扩张囊胚之间比较结果差异不显著(p>0.05)，但是扩张囊胚最高传至第5代，而早期囊胚传至第4代。胚胎级别对孵化率、贴壁率、P2代ES细胞集落形成率和最高传代数上都有很大的影响，不同发育阶段的不同级别胚胎之间结果差异显著(p<0.05)。