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猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）,为革兰氏阳性兼性厌氧菌,是一种新发的重要人兽共患病病原体,依据荚膜多糖的抗原性,猪链球菌可分为35个血清型（1～34型和1/2型）,其中猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2）是毒力最强,分布最广的血清型。人和猪感染后会导致脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症甚至导致急性死亡等。1998年和2005年分别两次在江苏省和四川省引起大规模感染,其严重威胁着养猪业的发展和人类的健康。近些年的研究发现,荚膜多糖（Capsular polysaccharide,CPS）、溶菌酶释放蛋白（Muramidase released protein,MRP）、胞外因子（Extracellular factor protein,EF）、溶血素（Suilysin,SLY）等物质是猪链球菌致病的主要毒力因子。磷脂酶A2（phospholipase A2,PLA2）是一种催化磷脂在sn-2位置水解的酶,可产生溶血磷脂和游离脂肪酸。哺乳动物PLA2可分为分泌型（s PLA2）、胞浆型（c PLA2）和非钙离子依赖型（i PLA2）。其中ⅡA型PLA2（PLA2G2A）是分泌型PLA2中研究最多的酶。PLA2G2A能单独或与杀菌/通透性增加蛋白（BPI）协同作用结合并穿透细菌细胞壁,水解细胞膜磷脂,使细菌细胞膜受损、破裂而杀死细菌。当宿主某部位有炎症或细菌感染时,PLA2G2A在该部位的浓度迅速增加,在此浓度下PLA2G2A能够有效的杀死感染的细菌,其在宿主防御细菌感染中起着重要的作用,被认为是固有免疫的一部分。目前,关于PLA2G2A的确切作用还不完善,对猪链球菌和PLA2G2A作用的研究也相对空白,因此研究猪链球菌与PLA2G2A之间的作用有助于完善猪链球菌与宿主相互作用的机制。在本研究中,我们首先通过体外实验证实PLA2G2A对猪链球菌的杀菌作用。在第一章的研究中,我们首先比较PLA2G2A对不同病原菌菌株的杀菌活性。PLA2G2A对革兰氏阴性病原菌没有明显的杀菌活性,与之相比,革兰氏阳性病原菌猪链球菌能够被其所杀灭,其存活率随浓度的升高逐渐降低。另外两种革兰氏阳性病原菌化脓链球菌和无乳链球菌对PLA2G2A更加敏感。证明猪链球菌可以被PLA2G2A有效杀伤,但需要较高的浓度。2148hk/rr基因是猪链球菌中的一个二元调控系统,与猪链球菌2型05ZYH33菌株和261菌株相比,突变株Δ2148hk/rr对PLA2G2A更敏感。另外比较了PLA2G2A对不同血清型猪链球菌杀菌作用,结果表明四种血清型的猪链球菌对PLA2G2A的作用表现出浓度和时间依赖性以及不同的敏感性,敏感性由强到弱依次为S7>S2>S9>S1,结合透射电镜观察相应菌株的形态,初步推断猪链球菌的荚膜影响PLA2G2A的杀菌作用。原子力显微镜观察测量结果显示,猪链球菌与PLA2G2A作用后,其表面电势改变,推测二者通过静电相互作用结合。特异性抑制剂和二价金属阳离子的作用结果,证明PLA2G2A依赖自身的磷脂酶酶活性发挥对猪链球菌的杀菌作用,其中二价金属阳离子起到重要作用。荚膜多糖是猪链球菌重要的毒力因子,在抵抗宿主免疫吞噬细胞吞噬过程中发挥重要作用。为了研究猪链球菌荚膜对PLA2G2A杀菌作用的影响,在第二章的研究中,我们首先构建了猪链球菌2型CPS基因簇缺失突变株ΔCPS,结合PCR鉴定和透射电镜观察形态证明构建成功,与野生株相比其表面荚膜缺失。Balb/c小鼠攻毒实验证明,突变株ΔCPS毒力下降。血中存活实验表明,突变株ΔCPS在血中存活能力减弱,更容易被清除,但在全血中加入PLA2G2A后,与未加相比,野生株05ZYH33的存活率降低,而突变株ΔCPS存活率无明显变化。体外杀菌实验表明突变株ΔCPS要达到与野生株05ZYH33相同的杀菌率,需要更高的PLA2G2A浓度,更长的作用时间。荚膜菌株比荚膜缺失菌株更敏感,我们推断是由于带负电的荚膜与带正电的碱性蛋白PLA2G2A亲和力更高,更容易结合。BLI实验证明,PLA2G2A和荚膜菌株具有更强的亲和力。本章的研究证明猪链球菌荚膜对PLA2G2A杀菌作用有正向影响。为了进一步研究猪链球菌与PLA2G2A的作用,在第三章我们研究猪链球菌对宿主PLA2G2A表达的影响。猪链球菌刺激人脑微血管内皮细胞后,在转录水平Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型PLA2有所表达,但检测不到PLA2G2A的表达。ELISA实验证明小鼠腹腔巨噬细胞系RAW 264.7 PLA2G2A表达水平低。同时Dot-Blot实验证明C3H/He N小鼠受到细菌感染后,循环中的PLA2G2A含量同样较低。因此我们选用已被应用于研究细菌与宿主PLA2G2A作用的豚鼠肺泡巨噬细胞（AMs）来进一步研究猪链球菌对宿主PLA2G2A表达的影响。猪链球菌与肺泡巨噬细胞作用后,实时定量PCR结果显示,猪链球菌能引起PLA2G2A表达的上调。但与野生株05ZYH33和互补株CΔSLY相比,突变株ΔSLY诱导AMs表达更高水平的PLA2G2A。重组猪链球菌溶血素r SLY单独和AMs作用,PLA2G2A表达水平无明显变化,LPS可引起PLA2G2A表达的上调,将LPS和r SLY共同与AMs孵育,结果显示随着r SLY浓度的增加,PLA2G2A表达水平逐渐降低,说明SLY对PLA2G2A的表达的有负向影响。另外猪链球菌2型腺苷合成酶缺失突变株ΔSsads和ΔSLY的效果类似。综上所述,本研究展示了PLA2G2A对猪链球菌的杀菌作用,表明了猪链球菌表面的荚膜对PLA2G2A杀菌作用的正向影响,证明了猪链球菌能够诱导宿主表达PLA2G2A,其相关毒力因子能限制PLA2G2A的表达,结果显示了猪链球菌与PLA2G2A相互作用的复杂性。