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目的:自RNA化学修饰发现以来,研究者陆续发现了超过150种RNA修饰。其中N~6-甲基腺苷(N~6-methyladenosine,m~6A),被证实是真核生物中含量最丰富的RNA化学修饰之一。生物体内不同水平的m~6A发挥着不同的生物学功能,而这些生物学功能的异常则是导致肿瘤和疾病的重要因素。由于m~6A不会改变其与T和U的碱基互补配对能力,因此不能用标准杂交或测序技术直接检测m~6A;此外,目前缺乏能有效区分m~6A和A的化学方法,且RNA不稳定化学处理过程中降解增多,导致m~6A检测技术的发展进一步受限;致使m~6A的确切生物学调控机制研究进展缓慢。因此,建立一种m~6A快速、准确检测方法对m~6A的研究有着重要意义。方法:本研究以抗m~6A抗体,既能识别RNA中的m~6A也能识别DNA中的m~6A为基础,建立了一种无标记且高特异的电化学免疫传感方法,用于RNA中m~6A的检测。首先,利用组氨酸标记的重组蛋白G(his-PG)将抗m~6A抗体定向固定于金电极表面,以提高抗原抗体结合效率;其次,以合成的类修饰DNA探针(L1)作为信号分子与m~6A-RNA竞争性结合抗m~6A抗体,以拓宽新方法的检测范围;然后,用核糖核酸酶(RNase A)水解与抗体结合的m~6A-RNA,以消除m~6A-RNA长度及碱基序列对检测结果造成的影响,提高准确度。最后,通过检测免疫传感器的电阻抗谱(EIS)信号,实现对RNA中m~6A的检测。结果:在最优的实验条件下,所构建的电化学免疫传感器具有较高的灵敏度和特异性。由于竞争机制的存在,该方法的线性范围较非竞争法有大幅增加,为0.05~200 nM;检测限低至0.016 nM(S/N=3)。此外,该免疫传感器成功实现了对HepG2、L02、HBE和A549细胞系总RNA中m~6A的检测。结论:本研究通过his-PG将抗m~6A抗体定向固定于金电极表面,不仅提高抗原抗体结合效率,而且也保证了每个抗体都能被抗原所饱和,提高方法的重复性。利用类修饰DNA探针作为信号分子与m~6A-RNA竞争结合抗m~6A抗体以扩大线性范围。同时利用RNase A的水解作用,消除了不同长度RNA和碱基序列对检测造成的干扰。在最优的实验条件下,实现了对不同细胞系来源的总RNA中m~6A的检测,证明所构建的电化学免疫传感器,具备准确检测生物样本来源的RNA中m~6A含量的潜力。