目的：肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是临床上十分常见的肝癌之一,发病率占原发性肝癌的80%以上。因肝细胞癌发病隐匿,不易发现和临床治疗手段较少等原因,肝细胞癌患者死亡率高,患者的五年生存率小于10%。目前手术切除和肝移植是早期肝细胞癌较好的治疗手段,但因肝细胞癌侵袭性高,转移能力强,早期临床诊断困难等原因,导致肝癌晚期患者的预后较差。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是肝细胞癌发生侵袭和转移的重要细胞表型之一,EMT主要指上皮细胞逐渐失去极性向具有运动性间充质表型转变的过程;EMT激活过程导致癌细胞发展迁移和侵袭能力。据报道多种分子可以通过调控EMT相关的转录因子,影响EMT发生和发展,并调控肿瘤细胞的侵袭转移。在对恶性肿瘤细胞以EMT为重要表型的多种生物学行为的调控中,表观遗传变化以及基因组异常转录发挥着重要的作用,尤其对肝细胞癌的进展影响较大,其中非编码RNA的发现及其对蛋白质的重要调控作用,为肝细胞癌的机制研究提供了一类新的研究方向。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200nt的内源性RNA分子,该类分子不翻译成蛋白质,具有一定的保守性、组织特异性和疾病特异性。lncRNA通过与小RNA（micro RNA,mi RNA）特异性结合,调控下游靶蛋白的表达和促进m RNA的降解;也可直接与靶蛋白结合,参与蛋白的功能调控。目前在多种癌症细胞中发现lncRNA的重要调控作用。有研究报道lncRNA在多种癌症中高表达并与不良预后相关,其中包括乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、上皮性卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等。lncRNA能参与调控多种恶性肿瘤的细胞表型,包括细胞增殖、细胞凋亡、侵袭和转移、上皮间质转化、血管新生和肿瘤耐药等。lncRNA的调控机制中,与mi RNA吸附的分子海绵机制是最重要的机制。但lncRNA在HCC中的表达和分子标记物仍需深入探讨,同时其对HCC生物学行为的调控作用也需实验验证。本研究旨在寻找调控肝细胞癌恶性表型的关键的lncRNA分子,并探究其作用机制,为寻找新的诊断指标和治疗靶点提供科学依据。研究方法：本研究第一部分,首先通过分析TGCA数据库的lncRNA芯片数据,结合R语言分析方法,筛选出在肝细胞癌表达上调的lncRNA。并采用q RTPCR方法分别对生物信息学分析结论进行验证,检测肝细胞癌组织、癌旁组织和多株肝细胞癌细胞系中表达上调的lncRNAs分子的表达水平。并通过原位荧光杂交（FISH）实验以及细胞核和细胞质分离实验,定位候选的lncRNA分子（lncLHC1）的亚细胞定位。进一步研究lncLHC1对肝细胞癌细胞的调控作用和分子机制。选择lncLHC1表达相对较高的肝细胞癌细胞系Huh7细胞,采用siRNA方法敲减Huh7细胞中的lncLHC1。并选择相对表达较低的肝细胞癌细胞系Hep G2细胞,通过转染lncLHC1过表达质粒进行过表达。经过PCR验证转染效率后,对细胞增殖变化采用CCK-8实验进行检测,对细胞凋亡的影响采用A/P双标法经流式细胞术进行测试,细胞迁移能力采用划痕愈合实验检测,细胞侵袭能力采用穿梭小室实验进行检测。同时对细胞中上皮-间质转化相关的E-钙粘蛋白,N-钙粘蛋白和波形蛋白进行了Western blot检测。第二部分:进一步探讨lncLHC1对肝细胞癌的调控作用机制。首先采用生物信息学预测与lncLHC1结合的几个靶mi RNA分子,经过RT-q PCR筛选确定研究的下游mi RNA分子为mi R-139-5p。同时采用生物信息学软件预测mi R-139-5p的靶点蛋白溶血卵磷脂酰基转移酶1（Lysophosphatidylcholine acyltransferase 1,LPCAT1）,并采用q RT-PCR测定LPCAT1 m RNA的表达量。原位荧光杂交（FISH）实验检测mi R-139-5p与lncLHC1的亚细胞定位。双荧光素酶报告基因实验验证外源性的mi R-139-5p能否与lncLHC1或LPCAT1 m RNA的结合。进一步采用RNA pull down实验检测mi R-139-5p与lncLHC1的靶向结合作用。并通过分别敲减lncLHC1或mi R-139-5p,以及同时敲减两者,比较他们对HCC细胞生物学行为的调控作用。同时通过分别过表达lncLHC1或mi R-139-5p,以及同时过表达两者,比较他们对HCC细胞生物学行为的调控作用,来验证lncLHC1通过调控mi R-139-5p的水平来调控HCC的细胞行为。随后通过过表达lncLHC1和同时过表达lncLHC1并敲减LPCAT1后,采用CCK-8,A/P双标的流式细胞术,划痕实验和穿梭小室实验以及Western blot分别对肝细胞癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭和上皮间质转化进行检测。为检测lncLHC1在体内的作用效果,采用慢病毒转染法制备敲减lncLHC1的HUH 7细胞系,将细胞注射到裸鼠皮下,定期对肿瘤体积进行检测。处死取材后,拍照,称重,免疫组织化学检测LPCAT1,Ki-67,E-钙粘蛋白和N钙粘蛋白的表达。结果：在第一部分研究中,首先下载TCGA数据库,经过R语言分析,筛选出在肝细胞癌组织中差异表达多个长链非编码RNA分子,共50个。选择其中对10个lncRNA,经过临床样本的RT-q PCR验证,发现lncLHC1在肝细胞癌中的表达量高于癌旁组织,且表达量高于其他候选lncRNA分子。同时经过临床分析发现lncLHC1的高表达与淋巴结转移相关。在荧光原位杂交与核质分离后的PCR实验结果显示lncLHC1主要分布于细胞浆。同时发现敲减lncLHC1后,CCK-8实验结果表明敲减lncLHC1后的肝细胞癌的细胞增殖率明显下调,过表达lncLHC1后细胞增殖率显著增加。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示敲减lncLHC1后,肝细胞癌凋亡率增加,过表达lncLHC1后细胞凋亡率降低。划痕愈合实验结果显示敲减lncLHC1后肝细胞癌细胞迁移能力减弱,同时过表达lncLHC1后肝细胞癌细胞迁移能力增强。穿梭小室实验结果显示敲减lncLHC1后肝细胞癌细胞侵袭能力降低,过表达lncLHC1后肝细胞癌细胞侵袭能力明显上调。对上皮间质转化相关蛋白的Western blot检测结果表明,敲减lncLHC1可抑制间质细胞标志物包括N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达,促进上皮细胞标志物E-钙粘蛋白蛋白的表达。过表达lncLHC1后则促进上皮细胞向间质细胞转化,即E-钙粘蛋白表达下调,N-钙粘蛋白和波形蛋白表达上调。lncLHC1在肝细胞癌组织中表达上调,该上调与肝细胞癌转移相关;同时发现lncLHC1能够促进肝细胞癌细胞的增殖、抑制细胞凋亡、同时促进细胞迁移、侵袭和细胞的上皮-间质转化作用。第二部分:通过表达数据库分析共预测出到3个可能与lncLHC1结合的mi RNA。PCR结果表明,mi R-139-5p的表达量受lncLHC1的调控最明显。同时发现mi R-139-5p在癌组织中表达较低,其表达量与肝癌患者生存期呈负相关,mi R-139-5p表达量和lncLHC1表达呈负相关。双荧光素酶报告基因实验结果显示,mi R-139-5p mimics+lncLHC1野生序列组的荧光强度明显下降。RNA pull down实验结果显示,包含lncLHC1序列的探针富集产物有mi R-139-5p分子。通过双荧光素酶报告基因实验和RNA pull down实验能够证明,lncLHC1能够吸附mi R-139-5p,调控mi R-139-5p在细胞中的水平。在功能挽救实验研究中发现,细胞中敲减mi R-139-5p能够有效逆转敲减lncLHC1引起的肝细胞癌的生物学行为的改变,具体包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移和侵袭以及上皮-间质转化等表型;细胞中过表达mi R-139-5p能够有效逆转过表达lncLHC1引起的促进肝细胞癌的生物学行为的作用,具体包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移和侵袭以及上皮-间质转化等表型。该结果说明lncLHC1对细胞的调控需要通过下调mi R-139-5p来实现。随后LPCAT1经生物信息学网站预测,并作为mi R-139-5p的候选靶基因进行研究。经过RT-PCR检测发现LPCAT1在癌组织中高表达,其表达水平与mi R-139-5p负相关,同时LPCAT1高表达与患者不良预后正相关。进一步采用双荧光素酶报告基因实验和RNA pull down实验发现,mi R-139-5p特异性的结合到LPCAT1 m RNA上的3’UTR。细胞功能挽救实验结果表明,lncLHC1过表达并敲减LPCAT1蛋白,能够部分抑制过表达lncLHC1引起的促肝细胞癌发展的作用。上述结果表明LPCAT1是lncLHC1/mi R-139-5p axis下游调控分子,共同参与细胞表型的调控。裸鼠皮下成瘤实验的结果显示,lncLHC1稳定敲减组的肿瘤体积和重量均小于对照组,Ki-67、LPCAT1、N-钙粘蛋白和Vimentin的表达低于对照组,E-钙粘蛋白的表达高于对照组。上述结果在体内证明敲减lncLHC1能够抑制肝细胞癌细胞的生长与上皮间质转化。结论：1.lncLHC1是肝细胞癌的促癌lncRNA分子。lncLHC1是定位于细胞质中,在肝细胞癌中显著上调的lncRNA之一。lncLHC1高表达的患者更容易发生淋巴结转移。2.lncLHC1能促进肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭以及上皮间质转化,并抑制癌细胞凋亡。3.lncLHC1作为分子海绵特异性的吸附mi R-139-5p,减少mi R-139-5p对LPCAT1的靶向抑制作用;lncLHC1通过下调mi R-139-5p并促进LPCAT1的表达水平,促进肝细胞癌的增殖、抑制细胞凋亡,促进细胞迁移和侵袭以及上皮间质转化,因此lncLHC1是促进肝细胞癌生物学进展的关键分子。