论文部分内容阅读
第一部分抑制海马miR-132通过上调Mecp2损伤学习记忆的机制研究背景：microRNA (miRNA)是一类短的(大约21-22nt)、遗传上非常保守的非编码RNA。miRNA首先在核内转录形成pri-miRNA,并被核内的内切酶Drosha/SGCR8剪切形成pre-miRNA,在出核素5(importin5)作用下转运至胞浆。胞浆核酸酶Dicer剪切pre-miRNA生成双链miRNA,其中一条单链miRNA和Ago蛋白形成诱导沉默复合物(RISC),另一条链通常会降解。在动物体内,miRNA通常通过结合靶点蛋白mRNA的3’末端的非转录区抑制其翻译或者使mRNA降解。miRNAs对神经元的发生、分化、迁移、融合以及整个脑功能都有重要的作用。海马和皮质等组织富含miR132,并且miR132高表达于神经元。miR132在一些神经退行性疾病中表达下调,如阿尔茨海默病、亨廷顿病和精神分裂症。过表达miR132可以通过抑制一种GTP酶活性依赖蛋白p250GAP的表达,而诱导皮质和海马区树突的外向性生长和改变树突的形态；并且体内敲除miR132则会导致突触的减少和抑制新生神经元的迁移；原代培养的神经元中敲除miR132导致FOXO3a的表达升高而诱导大量的神经元凋亡；体内敲除miR132能够减少突触释放和损伤新物体识别记忆。以上报道均提示miR132与神经元的形态和功能密切相关、与脑的认知功能相关。目前,miR132调控学习记忆的机制还不清楚。目的：观察抑制海马miR132功能对小鼠学习记忆影响并探讨相关机制。材料与方法：本实验采用雄性C57/BL。首先检测了老龄鼠(22月龄)和成年鼠(3月龄)脑内皮质和海马区的miR-132以及PSD95、NR2B、GluRl的蛋白水平。接着采用大脑立体定位技术通过微量注射泵于海马齿状回(DG)区内注射miR132的抑制剂LNA-Inhibitor-miRl32(LNA-miR132)抑制海马内源性miR-132的功能,同时设置LNA-Scramble为无关对照以及生理盐水为阴性对照。通过水迷宫(Morris Water Maze)、电跳台(StepDown)、恐惧场景记忆(Fear Conditioning)行为学检测了LNA-miR132组,LNA-Scramble组和盐水组小鼠的学习记忆能力。实时荧光定量PCR (Real-Time PCR)、免疫印迹(Western blotting)、脑片免疫荧光技术检测了LNA-miR132组和LNA-Scramble组的miR-132靶蛋白Mecp2的蛋白和mRNA水平,同时也检测了各组突触蛋白的mRNA和蛋白水平。并且通过在LNA-miR132组和LNA-Scramble组小鼠DG区注射腺相关病毒感染神经元观察了海马DG区和CA1区细胞的树突棘密度。通过构建野生型和突变型Mecp23’端UTR的荧光素酶表达载体确认miR-132和靶蛋白Mecp23’端UTR区的直接结合。电生理技术记录了LNA-miR132组和LNA-Scramble组CA3-CA1神经回路的LTP诱导和表达水平。并且通过免疫共沉淀确认了Mecp2的下游作用分子。最后通过siRNA (Short interferingRMA)降低Mecp2的蛋白水平去逆转抑制miR132导致的学习记忆损伤。结果：22月龄鼠皮质和海马中的miR132表达水平明显低于3月龄鼠,同时伴随着PSD95, NR2B, GluR1的蛋白水平下降。海马齿状回注射LNA-miR13248小时后,海马组织的miR132水平降低了90%以上。同时水迷宫检测发现,LNA-miR132组小鼠在学习的6、7天到达平台的潜伏期明显长于对照组,在记忆检测阶段穿越平台次数和在目标象限停留的时间显著低于对照组。StepDown检测结果显示LNA-miR132组小鼠在平台停留的潜伏期显著短于对照组。Fear Conditioning检测发现LNA-miR132组小鼠的Freezing百分率和次数明显减少,说明小鼠的恐惧学习记忆能力形成障碍。提取LNA-miR132组及对照组小鼠海马组织的突触小体,免疫印迹结果显示LNA-miR132组小鼠突触蛋白GluR1、GluR2、PSD95、NR2A、NR1明显下调；形态学研究发现同对照组相比LNA-miR132组小鼠海马DG和CA1区神经元的树突棘密度显著减少。在培养的海马脑片上记录细胞外场电位,结果提示同对照组相比LNA-miR132组小鼠LTP在强直性增强后迅速衰减。为深入研究参与miRl32下调引起学习记忆障碍的靶蛋白,结合生物信息学分析及前期报道,我们利用荧光素酶报告系统确认了miR-132直接和靶蛋白Mecp2的3’末端UTR区结合；而且利用免疫共沉淀技术证实了Mecp2可以和下游的HDAC2相互作用。为进一步证实Mecp2的关键作用,我们通过siRNA降低Mecp2蛋白水平,发现Mecp2蛋白水平降低可以逆转LNA-miR132诱导的海马依赖的学习记忆损伤和LTP形成障碍。结论：海马miR-132的表达降低,下调了突触蛋白的水平,并且减少了海马神经元树突棘的数目,进而抑制了海马LTP的形成,最终损伤了小鼠的学习记忆能力。miR-132的表达降低引起Mecp2的蛋白水平上调,结合更多的HDAC2,进而引起突触蛋白的下调是其中的关键机制。降低Mecp2蛋白水平可以逆转LNA-miR132诱导的上述海马依赖性学习记忆受损和LTP形成障碍。本研究结果提示了miR-132对Mecp2蛋白的靶向调控在学习记忆中的重要作用。第二部分EAPC2结合SURl抑制钾离子通道开放性背景：EPAC(Exchange Proteins Activated by cAMP)属于一类新的cAMP受体家族。迄今发现有两种EAPC成员,分别是EPAC1和EPAC2。每一个EPAC成员都有多个结构域,其中包含一个(EPAC1)或者两个(EPAC2)cAMP调控结构域和一个鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)。EPAC蛋白在全脑呈广泛性表达,包括海马,纹状体和前脑。前期的研究中,我们发现EPAC1和EPAC2双敲除小鼠减少了突触前末端的谷氨酸释放,谷氨酸的释放需要突触前末端的突触和囊泡的融合以及钙离子内流。.另外,我们前期研究还证实在海马神经元的突触前末端存在由Kir6.1和SUR1(ATP敏感性钾通道(KATP)1型磺脲类受体)组成的ATP敏感的钾离子通道。而KATP主要受—些代谢因子的控制比如ATP/ADP的比率。另外,有报道证实在胰腺的p细胞,EPAC2蛋白能够直接和KATP目互作用从而控制钙离子依赖的胰岛素分泌。那么在神经系统,EPAC是否调控KATP现在还不清楚。目的：探讨EPAC和SUR1的相互作用在中枢神经系统调控KATP的机制。材料方法：实验动物为3月龄的C57/BL小鼠和C57/BL小鼠来源的EPAC1敲除(EPA1C-/-), EPAC2(EPAC2-/-)敲除,EPAC1/2双敲除(EPAC-/-), SUR1敲除(SUR1-/-和Kir6.1敲除(Kir6.1/-/)小鼠。首先提取野生型和SUR1-/-的海马突触小体,采用免疫共沉淀的方法鉴定EPAC和钾离子通道组成蛋白的相互作用关系。构建表达了一系列EPAC2和SUR1的缺失突变体,采用免疫共沉淀的方法确认EPAC2和SUR1相互作用的关键位置。利用上述的转基因小鼠相互杂交生产更多表型的转基因小鼠包括：EPAC敲除SUR1阳性小鼠(EPAC-/-/SUR1+/+), EPAC Kir6.1双敲除小鼠(EPAC-/-/Kir6.1-/-), EPAC阳性Kir6.1敲除小鼠EPAC+/+/Kir6.1-/-和EPAC SUR1双敲除小鼠(EPAC-/-/SUR1-/-mice)。采用单通道记录技术观察以上双转基因小鼠KATP的电流和开放性。通过注射rAAV病毒在野生型,EPAC-/-/SUR1+/+,EPAC-/-Kir6.1-/-和EPAC-/-/SUR1-/-小鼠海马DG区表达SUR1859-881的蛋白片段,二周后检测各个组小鼠海马KATP的开放性。结果：野生型小鼠的免疫共沉淀结果显示EPAC1, EPAC2和SUR1,Kir6.1之间可以相互作用。但是EPAC2同Kir6.1和SUR1的杂交信号明显强于EPAC1。EPAC2和Kir6.1的结合在SUR1-/-小鼠海马提取突触小体中被抑制。连续的EPAC2和SURl缺失突变体免疫共沉淀结果证实EPAC2和SUR1的相互作用是发生在EPAC2的351-458位氨基酸和SUR1的859-881位氨基酸,并且这种结合在体外可以被SUR1859-881的蛋白片段竞争性抑制。电生理结果显示野生型小鼠的KATP开放性很低(EPAC+/+/SUR1+/+), EPAC-/-/SUR1+/+小鼠的KATP开放性却明显增加。但是这种增加在EPAC-/-/SUR1-/-小鼠和PAC-/-/Kir6.1-/-小鼠是被抑制的。另外,同对照病毒和其他转基因小鼠比较,表达SUR1859-881蛋白的EPAC+/+/SUR1+/+小鼠的KATP开放性明显增强。结论：EPAC通过和KATP组成蛋白SUR1的相互作用抑制了通道的开放性,而且这种抑制效应是在EPAC2351-45和SUR1859-881的相互作用介导。并且在体内可以通过表达SUR1859-881片段区消除这种抑制而增减钾离子通道的开放性。