论文部分内容阅读
第一部分:Piezo1对肠上皮屏障功能的调节作用目的:研究Piezo1在肠上皮细胞中的表达及对肠上皮屏障功能的影响。方法:采用慢病毒包装Piezo1 sh RNA和sg RNA,感染Caco-2细胞,使其低表达和过表达Piezo1基因,干预Caco-2细胞系,分为四组:Piezo1-KD干预组、Piezo1-OV干预组,CON-KD干预组和CON-OV干预组,通过免疫荧光、RT-PCR和Western Blot分别检测Piezo1、Claudin-1、Occludin、ZO-1的m RNA和蛋白表达水平。将Caco-2细胞接种于Transwell板构建体外上皮屏障模型,分别用Piezo1激动剂（Yoda1）和抑制剂（钌红、Gs MTx4）,干预Caco-2细胞系和小鼠结肠上皮,分为四组:对照组,钌红（Ru R）处理组（6μg/ml）,Gs MTx4处理组（2μg/m L）和Yoda1处理组（1μg/m L）。采用Ussing chamber分别测定Caco-2细胞构建的体外上皮屏障和小鼠结肠粘膜层的跨膜电阻（TEER）及其对异硫氰酸荧光素-右旋糖苷（FITC-dextran）的通透能力。结果:1.Piezo1在Caco-2细胞和小鼠结肠上皮细胞中有明显的表达,主要位于细胞膜。2.慢病毒包装Piezo1 sh RNA和sg RNA感染Caco-2细胞后,能显著降低和增加Piezo1的表达（P<0.05,P<0.05）;Piezo1低表达组（Piezo1-KD）较对照组TEER值更高（492.68±23.39 vs.431.85±27.56Ω,cm~2,n=6,P=0.003）,FITC-葡聚糖透过率无显著性差距(0.45±0.02 vs.0.44±0.02 ng×m L-1cm-2min-1,n=6,P=0.085)。Piezo1过表达组（Piezo1-OV）组TEER值有明显降低（224.68±22.24 vs 393.05±44.00Ω×cm~2,n=6,P<0.001）,FITC-葡聚糖透过率增加(0.45±0.02 vs.0.44±0.02 ng×m L-1cm-2min-1,n=6,P=0.085)。Piezo1低表达组（Piezo1-KD）Claudin-1表达增加（n=6;P=0.024,P=0.0006）,在Piezo1过表达组（Piezo1-OV）中Claudin-1的m RNA及蛋白表达显著下降(（n=6;P=0.016,P<0.001）。Piezo1-OV组中Occludin表达增加（P=0.002）。Piezo1-KD组中Occludin m RNA和蛋白表达无明显差异（n=5;P=0.431,P=0.474）,Piezo1-KD组和Piezo1-OV组ZO-1 m RNA和蛋白表达无明显变化（n=6;P=0.079,P=0947）。在Caco-2细胞中,Piezo1与Claudin-1存在共定位。3.Piezo1抑制剂Ru R和Gs MTx4抑制Piezo1通道开放后,与对照组相比,TEER值升高（426.0±6.19 and 428.27±6.74 vs 432.0±5.42Ω×cm~2,n=6;P=0.027,P=0.006）。Gs MTx4抑制Piezo1通道开放后,FITC-葡聚糖透过率较对照组下降(0.44±0.03 vs 0.53±0.02 ng×m L-1cm-2min-1,n=6,P=0.03)。Yoda1激活Piezo1通道开放后,与对照组相比,TEER显著下降,FITC-葡聚糖透过率增加（78.90±2.88 vs 54.00±3.57Ω×cm~2,n=5,P=0.006）。小鼠肠道组织中,Yoda1激活Piezo1通道开放可以显著降低TEER（78.90±2.88 vs 54.00±3.57Ω×cm~2,n=5,P=0.006）,FITC-葡聚糖透过率增加(0.64±0.03 ng×ml-1cm-2min-1,n=6,P<0.001)。结论:Piezo1蛋白活化和表达参与调节肠上皮屏障功能,并且Piezo1可以通过影响Claudin-1和Occludin的表达来调控上皮屏障。第二部分Piezo1通过ROCK1/2通路参与调节肠上皮屏障功能目的:研究ROCK1/2通路在Piezo1调节肠上皮屏障功能中的作用;方法:采用慢病毒包装Piezo1 sh RNA和sg RNA,感染Caco-2细胞分别低表达和过表达Piezo1,采用ROCK1/2抑制剂Y-27632、ROCK1/2激动剂U-46619干预Caco-2细胞,分为八组:CON-KD干预组,PIEZO-KD干预组,CON-KD+Y-27632干预组,Piezo1-KD+Y-27632干预组;CON-OV干预组,Piezo1-OV干预组,CON-OV+U46619干预组,Piezo1-OV+U46619干预组。应用免疫荧光、RT-PCR和Western Blot检测Claudin-1、ZO-1、Occludin的m RNA和蛋白表达。应用RT-PCR和Western Blot检测ROCK1/2、Erk1/2的表达。结果:1.Piezo1-KD组中Caco-2细胞ROCK1和ROCK2表达增加（n=5,6;P<0.001,P<0.001）,Piezo1-OV组中则表达下降（n=5,6;P=0.002,P=0.003）。Piezo1-KD组中磷酸化的Thr455/Ser456 ROCK1和Ser1366 ROCK2表达增加（n=6;P=0.034,P<0.001）Piezo1-OV组中表达下降（n=6;P=0.035,P=0.003）。Piezo1-KD和Piezo1-OV组中Erk1/2的表达则无显著差异（n=6;P=0.952,P=0.923）。2.Piezo1-KD组,ROCK1/2抑制剂Y-27632显著降低Claudin-1的表达（n=6,P<0.001）,ROCK1/2激动剂U-46619干预后的CON-OV组Claudin-1较CON-OV组无明显改变（n=6,P=0.074）。同时,U-46619可升高Piezo1-OV组中Claudin-1的表达（n=6,P0.05）。1 Piezo1调控下游ROCK1/2通路的表达2干预ROCK1/2可以逆转Piezo1对紧密连接蛋白Claudin-1的影响。