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[目的]通过体外细胞实验验证CSWT预处理能否抑制缺氧/复氧诱导的H9C2细胞凋亡,并进一步探讨CSWT是否通过激活PI3K/Akt、ERK1/2信号通路发挥抑制H9C2细胞凋亡的作用,同时揭示以上2个信号通路在CSWT抑制H9C2细胞凋亡的效应中是否有协同。为将来探讨CSWT预处理缺血再灌注损伤患者保护效应的相关临床研究提供理论依据,也为今后进一步拓展CSWT治疗缺血性心脏病(IHD)的分子机制研究奠定基础。[方法]选用来源于胚胎期大鼠心脏组织的H9C2细胞作为研究对象,分为正常对照组(control组)、缺氧/复氧组(A/R组)、CSWT+缺氧/复氧组(CSWT+A/R组)、LY294002+缺氧/复氧组(LY294002+A/R 组)、PD98059+缺氧/复氧组(PD98059+A/R 组)、LY294002+PD98059+缺氧/复氧组(LY294002+PD98059+A/R 组)、LY294002+CSWT+缺氧/复氧组(LY294002+CSWT+A/R 组)、PD98059+CSWT+缺氧/复氧组(PD98059+CSWT+A/R 组)、LY294002+PD98059+CSWT+缺氧/复氧组(LY294002+PD98059+CSWT+A/R 组),其中 LY294002、PD98059 分别为PI3K/Akt、ERK1/2信号通路抑制剂。予以CSWT预处理(每份标本均以0.09mJ/mm2能量水平给予500个脉冲波),运用模拟缺血/再灌注液培养法构建H9C2细胞缺氧/复氧模型,应用CCK8比色法、流式细胞技术分别检测各组细胞的存活及凋亡情况,RT-PCR检测各组细胞培养物中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA 转录情况;Western-blot 检测细胞培养物中 Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-AKT、p-ERK1/2的蛋白表达水平。为进一步研究CSWT预处理是否通过PI3K/Akt信号通路、ERK1/2信号通路调控缺氧/复氧诱导H9C2细胞的凋亡,予LY294002、PD98059预处理细胞分别阻断上述两条通路,同样的检测各组心肌细胞的增殖及凋亡情况,各组细胞培养物中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA转录情况及Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-AKT、p-ERK1/2 的蛋白表达水平。[结果]1、CCK8法检测各组H9C2细胞存活率情况:与Control组比,A/R组细胞存活率降低(73.40±5.23 vs 100.00±3.34,P<0.05)。与 A/R组细胞存活率(73.40±5.23)相比,LY294002+A/R组(49.22±3.63)、PD98059+A/R组(60.97±4.48)细胞存活率降低(P均<0.05),A/R+CSWT组(96.88±6.55)细胞存活率增加(P<0.05)。与 A/R+CSWT 组(96.88±6.55)相比,Ly294002+A/R+CSWT 组(67.01±4.71)、PD98059+A/R+CSWT 组(77.29±1.55)细胞存活率降低(P 均<0.05)。与LY294002+A/R 组(49.22±3.63)相比,Ly294002+PD98059+A/R 组(41.06±1.42)细胞存活率降低,PD98059+A/R组(60.97±4.48)细胞存活率增加(P均<0.05)。与 PD98059+A/R 组(60.97±4.48)相比,Ly294002+PD98059+A/R 组(41.06±1.42)存活率降低(P<0.05)。与 Ly294002+PD98059+A/R+CSWT 组(55.95±4.82)相比,Ly294002+A/R+CSWT 组(67.01±4.71)、PD98059+A/R+CSWT 组(77.29±1.55)细胞存活率增加(P 均<0.05),Ly294002+PD98059+A/R 组(41.06±1.42)细胞存活率降低(P<0.05)。PD98059+A/R+CSWT 组与 Ly294002+A/R+CSWT 组相比,细胞存活率增加(77.29±1.55vs67.01±4.71,P<0.05)。2、流式细胞技术检测各组H9C2细胞凋亡率情况:A/R组与Control组比,细胞凋亡率增加(6.29±0.21vs3.08±0.26,P<0.05)。与 A/R组(6.29±0.21)相比,LY294002+A/R 组(9.54±0.25)、PD98059+A/R 组(7.95±0.39)细胞凋亡率增加(P 均<0.05),A/R+CSWT 组(3.83±0.46)凋亡率减少(P<0.05)。与 A/R+CSWT组(3.83±0.46)相比,Ly294002+A/R+CSWT 组(5.83±0.29)、PD98059+A/R+CSWT组(4.72±0.26)细胞凋亡率增加(P 均<0.05)。与 LY294002+A/R组(9.54±0.25)相比,Ly294002+PD98059+A/R 组(11.7±1.31)细胞凋亡率增加,PD98059+A/R组(7.95±0.39)细胞凋亡率减少(P 均<0.05)。与 PD98059+A/R组(7.95±0.39)相比,Ly294002+PD98059+A/R组(11.7±1..31)细胞凋亡率增加(P<0.05)。与Ly294002+PD98059+A/R+CSWT(6.82±0.47)相比,Ly294002+A/R+CSWT组(5.83±0.29)、PD98059+A/R+CS WT 组(4.72±0.26)细胞凋亡率减少(P 均<0.05),Ly294002+PD98059+A/R 组(11.7±1.31)细胞凋亡率增加(P<0.05)。PD98059+A/R+CSWT组与Ly294002+A/R+CSWT组相比,细胞凋亡率减少(4.72±0.26vs5.83±0.29,P<0.05)。3、RT-PCR检测各组H9C2细胞抗凋亡基因Bcl-2、促调亡基因Bax和Casepase-3的mRNA转录情况示:与Control组相比,A/R组Bcl-2的mRNA转录水平降低(0.40±0.02 vs 1±0.00,P<0.05),Bax 和 Caspase3 的 mRNA 转录水平升高(3.00±0.24 vs 1±0.00,1.89±0.16 vs 1±0.00,P 均<0.05)。与 A/R 组相比,LY294002+ A/R 组、PD98059+A/R 组 Bcl-2 的 mRNA 转录水平降低(0.25±0.02 vs 0.40±0.02,0.30±0.01vs0.40±0.02,P 均<0.05),Bax 和 Caspase3 的 mRNA 转录水平在上述组间比较结果与Bcl-2相反。A/R+CSWT组与A/R组相比,Bcl-2 mRNA 转录水平升高(0.85±0.01 vs 0.40±0.02,P<0.05),Bax 和 Caspase3 的mRNA 转录水平降低(1.11±0.07 vs 3.00±0.24,1.07±0.09 vs 1.89±0.16,P均<0.05)。与 A/R+CSWT 组相比,Ly294002+A/R+CSWT 组、PD98059+A/R+CSWT组 Bcl-2 的 mRNA 转录水平降低(0.53±0.08 vs 0.85±0.01,0.64±0.03 vs 0.85±0.01,P 均<0.05),Bax 的 mRNA 转录水平升高(2.06±0.24 vs 1.11 ±0.07,1.47±0.15 vs 1.11±0.07,P 均<0.05),且 Ly294002+A/R+CSWT 组 Caspase3 的 mRNA 转录水平也升高(1.74±0.16 vs 1.07±0.09,P<0.05)。与 LY294002+A/R 组比,Ly294002+PD98059+A/R 组 Bcl-2 的 mRNA 转录水平降低(0.16±0.02 vs 0.25±0.02,P<0.05),Bax 和 Caspase3的mRNA 转录水平升高(7.86±0.16 vs 5.40±0.05,5.71±0.25vs4.36±0.04,P 均<0.05),而 PD98059+A/R 组 Bcl-2 的mRNA 转录水平升高(0.30±0.01 vs 0.25±0.02,P<0.05),Bax 和 Caspase3 的mRNA 转录水平降低(3.84±0.17vs 5.40±0.05,3.06±0.26vs4.36±0.04,P均<0.05)。与 PD98059+A/R 相比,Ly294002+PD98059+A/R 组 Bcl-2的mRNA 转录水平降低(0.16±0.02vs0.30±0.01,P<0.05),而 Bax 和 Caspase3 的 mRNA转录水平升高(7.86±0.16vs3.84±0.17,5.71±0.25vs3.06±0.26,P 均<0.05)。与Ly294002+PD98059+A/R+CSWT 相比,Ly294002+A/R+CSWT 组和 PD98059+A/R+CSWT 组 Bcl-2的mRNA 转录水平升高(0.53±0.08 vs 0.38±0.01,0.64±0.03 vs 0.38±0.01,P均<0.05),而Bax和Caspase3的mRNA转录水平在上述组间比较结果与 Bcl-2 相反。Ly294002+PD98059+A/R 组与 Ly294002+PD98059 +A/R+CSWT 相比,Bcl-2 的 mRNA 转录水平降低(0.16±0.02 vs 0.38±0.01,P<0.05),而 Bax 和 Caspase3 的 mRNA 转录水平升高(7.86±0.16 vs 2.97±0.40,5.71±0.25 vs 2.26±0.18,P 均<0.05)。PD98059+A/R+CSWT 与 Ly294002+A/R+CSWT 比较Bcl-2mRNA 转录水平升高(0.64±0.03vs0.53±0.08,P<0.05)、Bax 和 Caspase3的mRNA转录水平降低(1.47±0.15vs 2.06±0.24,1.20±0.16vs 1.74±0.16,P均<0.05)。4、Western-blot检测各组细胞抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、Casepase-3的表达情况示:与Control组相比,A/R组Bcl-2蛋白相对表达量明显减少(0.56±0.04 vs 1.54±0.09,P<0.05),Bax 和 Caspase3 的相对表达量增加(0.54±0.04 vs 0.08±0.01,0.16±0.04vs0.06±0.01,P<0.05)。与 A/R组相比,LY294002+A/R组和 PD98059+A/R 组 Bcl-2 相对表达量降低(0.15±0.01 vs 0.56±0.04,0.36±0.06 vs 0.56±0.04,P 均<0.05),Bax 相对表达量增加(0.87±0.02vs0.54±0.04,0.68±0.03 vs0.54±0.04,P均<0.05),且LY294002+A/R组Caspase3 的相对表达量也增加(0.27±0.03 vs 0.16±0.04,P<0.05),A/R+CSWT 组 Bcl-2 相对表达量增加(0.84±0.06 vs 0.56±0.04,P<0.05),而 Bax 和 Caspase3 的相对表达量降低(0.11±0.01vs0.54±0.04,0.07±0.01vs0.16±0.04,P 均<0.05)。与 A/R+CSWT组比,Ly294002+A/R+CSWT组Bcl-2相对表达量明显降低(0.68±0.06 vs 0.84±0.06,P<0.05)、Bax 及 Caspase3 相对表达量增加(0.21±0.03 vs0.11±0.01,0.14±0.02 vs 0.07±0.01,P 均<0.05),PD98059 +A/R+CSWT 组 Bax 相对表达量明显增加(0.16±0.01 vs 0.11±0.01,P<0.05)。与 LY294002+A/R 组比,Ly294002+PD98059+A/R 组Bcl-2 相对表达量降低(0.06±0.01 vs 0.15±0.01,P<0.05)、同时 Bax 和 Caspase3 的相对表达量升高(1.11±0.02 vs 0.87±0.02,0.54±0.09vs0.27±0.03,P 均<0.05),而 PD98059 + A/R 组 Bcl-2 相对表达量增加(0.36±0.06 vs 0.15±0.01,P<0.05)、同时 Bax 和 Caspase3 的相对表达量降低(0.68±0.03 vs 0.87±0.02,0.20±0.02 vs 0.27±0.03,P 均<0.05)。与PD98059+A/R 组相比,Ly294002+PD98059+A/R 组 Bcl-2 相对表达量降低(0.06±0.01 vs0.36±0.06,P<0.05)、Bax和Caspase3的相对表达量加(1.11±0.02 vs 0.68±0.03,0.54±0.09 vs 0.20±0.02,P<0.05)。与 Ly294002+PD98059+A/R+CSWT 相比,PD98059+A/R+CSWT 组 Bcl-2 相对表达量升高(0.85±0.05 vs 0.47±0.06,P<0.05)、Bax 和 Caspase3 的相对表达量降低(0.16±0.01 vs 0.37±0.01,0.08±0.01vs0.17±0.03,P 均<0.05),Ly294002+A/R+CSWT 组Bcl-2 相对表达量升高(0.68±0.06vs0.47±0.06,P<0.05)、Bax 的相对表达量降低(0.21±0.03 vs 0.37±0.01,P<0.05),Ly294002+ PD98059+ A/R 组 Bcl-2 相对表达量降低(0.06±0.01vs 0.47±0.06,P<0.05)、Bax和Caspase3的相对表达量升高(1.11±0.02 vs 0.37±0.01,0.54±0.09 vs 0.17±0.03,P 均<0.05)。PD98059+A/R+CSWT 与Ly294002+A/R+CSWT 比较 Bcl-2 的相对表达量升高(0.85±0.05 vs 0.68±0.06,P<0.05)、Bax 和 Caspase3 的相对表达量降低(0.16±0.01 vs0.21±0.03,0.08±0.01 vs0.14±0.02,P 均<0.05)。5、Western-blot检测各组细胞P-AKT、P-ERK蛋白表达情况:与Control组相比,A/R组P-AKT及P-ERK蛋白相对表达量明显降低(0.69±0.05 vs 0.98±1.05,0.27±0.03vs0.46±0.04,P均<0.05),而 A/R+CSWT组与 A/R组相比,P-AKT及P-ERK蛋白表达明显增加(0.97±1.12vs 0.69±0.05,0.38±0.06vs 0.27±0.03,P均<0.05)。与 A/R+CSW 相比,LY294002+A/R+CSWT 组 P-AKT 蛋白的相对表达量明显减少(0.72±0.82 vs 0.97±1.12,P<0.05),PD98059 +A/R+CSWT 组 P-ERK蛋白的相对表达量明显减少(0.25±0.01 vs0.38±0.06,P<0.05)。[结论]1、缺氧/复氧诱导H9C2细胞凋亡的发生,其通过抑制抗凋亡因子Bcl-2表达,促进促调亡因子Bax、Caspase-3表达来实现上述效应,提示缺氧/复氧可能是通过线粒体途径介导了 H9C2细胞凋亡的发生。2、PI3K/Akt信号通路和ERK1/2信号通路对H9C2细胞具有保护效应,能抑制缺氧/复氧诱导的H9C2细胞凋亡。3、CSWT预处理能激活PI3K/Akt信号通路和ERK1/2信号通路,调控其下游的凋亡相关因子的表达,抑制缺氧/复氧诱导的H9C2细胞凋亡。4、PI3K/Akt信号通路和ERK1/2信号通路在CSWT预处理抑制缺氧/复氧诱导的H9C2细胞凋亡的过程中存在协同作用,且以PI3K/Akt信号通路占主导地位。