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抗生素LP2是枯草芽孢杆菌SN-02 (Bacillus subtilis)产生的脂肽类抗生素。本文对其产生菌SN-02菌株进行了遗传改良、摇瓶发酵条件、发酵液代谢物理化性质、化学成分分析及纯化技术、发酵液对烟草靶斑病菌的作用机理进行了系统的研究。结果如下:
1.采用自然选育和紫外诱变相结合的方法对Bacillus subtilis进行了菌种改良,获得高产、高效、遗传稳定的菌株SN-02-3,它比原始菌株抑菌活性提高将近30%。确定紫外线最佳诱变剂量为90s,致死率约75%,正变率为30%。
2.以29种植物病原菌为供试菌,杯碟法测定改良菌株SN-02-3发酵液的抑菌谱:以烟草靶斑病菌为指示菌,杯碟法测定发酵液的热稳定性、酸碱稳定性、光照稳定性及耐储藏性。结果表明,SN-02-3发酵液抑菌谱较广,对27种供试植物病原菌的抑菌直径在25mm以上,尤其对黄瓜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、烟草靶斑病菌(Thanatephorus cumcumeris)等具有强烈的抑制作用。将发酵液于55℃、85℃、120℃处理2.5h抑菌活性没有明显变化;对强酸和强碱稳定性较差;耐储藏性和光稳定性较好。
3.通过单因子试验和正交试验明确了改良菌株SN-02-3的最佳配方。SN-02-3菌株的摇瓶发酵的最佳碳源是蔗糖,最佳氮源为花生饼粉,最佳培养基配方(%):牛肉膏0.5%或1%花生饼粉,蔗糖4%,NaC10.1%,NH<,4>NO<,3> 0.1%。明确了最佳发酵条件,最佳发酵条件:接种量0.5%;培养基起始pH6.8~7.5;装液量50ml/250ml三角瓶。研究表明,无机盐及微量元素对SN-02-3产生菌的摇瓶发酵具有一定的影响,在菌株SN-02-3发酵过程中适量的MnSO<,4>和K<,2>SO<,4>可提高发酵液活性;而FeSO<,4>和ZnSO<,4>则抑制抗生素的产生;加入少量MgSO<,4>后,发酵效果与对照相当。
4.进行了改良菌株发酵液产生活性物质的纯化技术研究,得到了抗生素LP2的粗品。pH层析研究表明,发酵液是多组分的。以氯仿:甲醇:水(65:25:4)为展层剂,利用薄层层析法(TLC)分析了各组分的化学成分,推测有两个组分为脂肽类抗生素,其中一个为本实验室已确定结构的表面活性素,用硅胶柱层析吸附色谱法得到了另一抗尘素LP2的粗品。
5.以烟草靶斑病菌(Thanatephorus cumcumeris)为指示菌,从对病原菌作用和对植株抗病性影响两方面研究了SN-02-3菌株发酵液防治病害的作用机理。结果表明,SN-02-3菌株发酵液对烟草靶斑病菌具有较强的抑制和杀菌作用。主要表现在:破坏菌丝体的细胞膜结构,导致细胞内含物外渗,菌丝体畸变、缢缩、断裂和溶解,使菌丝重量减少,从而抑制菌丝体的正常生长;但是其作用位点不是菌体的蛋白。SN-02-3无菌滤液也可诱导PPO、PAL酶活的提高,但是对POD、CAT的诱导不是很明显。