近年来,新发冠状病毒性疾病的不断出现（如SARS、MERS、COVID-19等）,迫使人类寻找有效地应对策略,从多方面建立控制突发疫情的手段及方法迫在眉睫。适宜的动物模型是疫苗及药物筛选的基础,建立能在P2实验室中应用且成本较低的冠状病毒小鼠肺炎模型,对于控制疫情、药物筛选及病毒免疫学研究具有重要意义。中医药治疗疫病有几千年的实践积累,自西汉至清末,有记载的大型瘟疫超过300余次,在此过程中形成了大量经典名方以及现代中药。中医药治疗疫病的理论及相关中药的应用是我国历次应对突发疫病的重要依据及手段[1][2]。近年来,在SARS、COVID-19治疗中积累了大量有价值的临床应用数据,其经验已向世界范围内推广。因此提供适宜动物模型的现代科学数据支持,是推动中医药走向世界不可或缺的条件。本文共分为两大部分:第一部分中建立了人类冠状病毒229E（HCoV-229E）小鼠肺炎模型:首先根据体外易感性、细胞病变程度、病毒载量等条件筛选建立体外模型。继而考察不同病毒体系、小鼠品系、感染量、感染次数等不同感染条件,建立人类冠状病毒229E（HCoV-229E）体内小鼠肺炎模型。最后以连花清瘟胶囊为阳性药建立了 HCoV-229E感染的小鼠肺炎模型的指标评价体系,使其达到客观化、科学化、标准化、规范化。第二部分为人类冠状病毒229E（HCoV-229E）小鼠肺炎模型的应用:在人类冠状病毒229E（HCoV-229E）小鼠肺炎模型基础上进一步应用该模型,对《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》[3]中推荐试用药物:干扰素、磷酸氯喹、金花清感颗粒、疏风解毒胶囊及相关方剂1-2、方剂2-2、方剂4-2对HCoV-229E小鼠肺炎模型的治疗作用进行研究。解决国家疫情期间药物筛选的亟需,也证明了该模型的可行性、稳定性和重复性。实验目的:本实验采用人类冠状病毒229E（HCoV-229E）建立了小鼠肺炎模型,以期构建适宜病毒复制,模拟冠状病毒临床症状,且能应用于冠状病毒药物筛选的新动物模型。为紧急疫情时期应急筛选有效的药物提供可行的动物模型,也为相关冠状病毒感染基础研究及新药研发奠定基础。实验方法:1 HCoV-229E体外感染体内外模型的建立体外实验中,采用HCoV-229E病毒感染人胚肺细胞、人肺癌细胞、巨噬细胞、犬肾细胞,通过考察各个细胞对HCoV-229E的易感性、细胞病变程度、病变出现的时间、细胞上清液中病毒载量,建立体外细胞模型。HCoV-229E动物感染模型中,共筛选了 3个小鼠品系:BALB/c小鼠、BALB/c-nude小鼠及ICR小鼠。病毒滴鼻感染后,通过肺指数及肺组织病毒载量检测筛选了不同病毒体系、小鼠品系、感染量、感染次数等造模条件。2 HCoV-229E感染的BALB/c小鼠肺炎模型评价指标的建立体内实验中,并采用连花清瘟胶囊作为阳性药进行小鼠肺炎模型评价指标的建立。BALB/c小鼠分别于第1天、第3天用异氟烷轻度麻醉后,以100 TCID50稀释度的HCov-229E病毒液经滴鼻感染,50μL/只。第5天进行肺部CT检测、淋巴细胞分型比例检测、肺指数及抑制率计算。HE染色进行肺组织及全身主要器官的组织病理学检查及肺组织病毒载量检测,并采用ELISA法进行肺组织中炎性细胞因子含量测定。3 HCoV-229E感染的BALB/c小鼠肺炎模型的应用应用HCoV-229E感染的BALB/c小鼠肺炎模型,进行西药（磷酸氯喹、干扰素α2b）,中药复方（方剂1-2、方剂2-2、方剂4-2）,上市中成药（金花清感颗粒、疏风解毒胶囊）药效学作用进行评价。造模方法同实验方法2,第5天进行淋巴细胞分型比例检测,进行肺指数及抑制率测定。采用RT-PCR进行肺组织病毒载量检测,采用ELISA法进行肺组织中炎性细胞因子含量测定。实验结果:1 HCoV-229E体外感染体内外模型的建立对HCoV-229E对MDCK、A549、MRC-5以及人类巨噬细胞4种细胞的易感性进行了评价,从病变程度、出现时间、稳定性、保存等方面最终选取了 A549细胞、MDCK细胞作为病毒增殖载体,HCoV-229E病毒对MDCK、A549的TCID50均为10-2。HCoV-229E动物感染模型中,本实验共筛选了 3个小鼠品系、2种病毒体系、2个病毒稀释度。其中采用A549培养病毒液在100 TCID50浓度经滴鼻感染1次,感染HCoV-229E 3天后,BALB/c小鼠及BALB/c-nude小鼠模型组肺指数均显著升高,肺指数均值大于0.9（P<0.01）,肺组织中病毒核酸显著增高（P<0.01）,达到模型建立标准。但感染4天后,小鼠肺指数及肺组织中病毒核酸表达明显降低,模型呈恢复趋势。在此基础上并进一步进行了感染次数考察,采用A549传代病毒液以100 TCID50稀释度,2次滴鼻感染BALB/c小鼠。第5天,模型对照组小鼠肺指数明显增高（肺指数>0.9,P<0.01）,肺组织中病毒核酸显著增高（P<0.01）,小鼠肺组织呈现弥漫性灶状肺泡坏死,并有部分肺泡支架塌陷,以上指标表明,该建模方法达到模型建立标准。2 HCoV-229E感染的小鼠肺炎模型评价指标的建立采用连花清瘟胶囊作为阳性药进行小鼠肺炎模型评价指标的建立,经滴鼻感染100 TCID50 HCoV-229E病毒2次,感染后5 d,HCoV-229E模型对照组小鼠体重下降>1g,肺指数较正常对照组显著升高（P<0.1）,肺组织中HCoV-229E核酸表达较正常组显著升高（P<0.1）。模型对照组小鼠肺组织匀浆中炎症因子IL-6、IL-10及TNF-α蛋白表达显著增高（P<0.1）。小鼠外周血中免疫细胞CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞的百分比均明显降低（P<0.1）。模型对照组肺部CT可见纹理增粗斑点状阴影。肺组织弥漫性肺泡坏死,肺泡支架塌陷,周围肺间隔增宽。全身主要脏器均出现与临床表现较为一致的病理学改变。治疗给予连花清瘟胶囊4天后,连花清瘟胶囊在其治疗范围内,肺指数及肺组织病毒载量、病毒核酸表达均有较为明显的改善作用。以上结果表明,小鼠体重、病毒载量、肺部炎症、炎症因子表达、淋巴细胞分型、CT及病理学改变可以做为HCoV-229E BALB/c小鼠轻症肺炎模型的评价指标。3 HCoV-229E感染的小鼠肺炎模型的应用磷酸氯喹及干扰素α2b经治疗性给药均有一定的治疗作用。磷酸氯喹可以明显降低炎症因子TNF-α的含量及升高CD8+T细胞百分比。磷酸氯喹可能通过抑制小鼠炎症及改善免疫发挥作用。干扰素α2b可以明显降低肺指数,抑制炎症因子TNF-α的表达,可能通过抑制炎症发挥作用。治疗性给药4天后,与模型组比较,方剂1-2、2-2在治疗范围内,可明显降低HCoV-229E感染的BALB/c小鼠肺指数、肺组织中HCoV-229E病毒载量、小鼠肺组织匀浆中炎症因子IL-6、IL-10及TNF-α含量,其中1-2小剂量、2-2大剂量组还能显著提高B细胞百分比。方剂4-2在治疗范围内,与模型组比较,均可显著降低肺指数,肺组织病毒载量、小鼠肺组织炎症因子IL-6、IL-10及TNF-α含量,其中小剂量组还能显著升高CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞的百分比。金花清感胶囊、疏风解毒胶囊在治疗范围内均可降低肺指数、肺组织HCoV-229E病毒载量及肺组织匀浆中炎症因子IL-6、IL-10及TNF-α的蛋白表达水平,其中金花清感胶囊小剂量组还能显著升高CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的百分比。疏风解毒胶囊小剂量能够显著升高CD3+T细胞和CD4+T细胞的百分比。实验结论:1成功建立了人类冠状病毒229E体内外感染模型。2构建了 HCoV-229E感染的小鼠肺炎模型评价指标评价体系。3应用HCoV-229E感染的小鼠肺炎模型,明确了金花清感颗粒、疏风解毒胶囊、方剂1-2、方剂2-2、方剂4-2的药效学作用,也证明了该模型的可行性、稳定性和重复性。创新点:1本实验首次建立了 HCoV-229E感染BALB/c小鼠肺炎模型,并形成规范的评价标准,国内外尚未见报道。2本研究为《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》[4]中推荐试用药物金花清感颗粒、疏风解毒胶囊、方剂1-2、方剂2-2、方剂4-2治疗HCoV-229E感染BALB/c小鼠肺炎模型的有效性提供了实验室基础。