研究背景 帕金森病(Parkinson’sdisease)是一种常见的中老年进行性神经系统变性疾病，黑质致密部多巴胺能神经元选择性变性、缺失是其主要的病理特征，临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌张力增高和姿势平衡障碍为主要表现。PD的病因及发病机制至今尚不清楚。目前治疗PD的主要手段仍为多巴胺替代疗法，然而多巴替代治疗并非是针对PD的病因治疗，它并不能延缓或阻止PD的病理进程。随着疾病的发展，多巴类药物疗效的减退和其越来越多的不良反应使众多的PD患者在疾病10-15年后陷入药物治疗的困境，迫切需要寻求新的治疗方法来阻止疾病的进展和改善临床症状。 随着帕金森病的研究进展，天然药物在治疗神经退行性病中的作用已经引起广泛的关注。灵芝孢子粉是中医药学宝库中的珍品，它具有抗癌作用，抗艾滋病毒，对机体的免疫调节作用，且对受损伤的神经元具有保护作用。灵芝孢子粉中含有多种生物活性物质，有广泛的药理作用。另外有研究发现灵孢多糖(GanodermalucidumpolysaccharidesGLPS)对于Hypoxia/Reoxygenation引起的大脑皮层神经元损伤具有神经保护作用。因此值得深入研究灵芝孢子治疗PD的可行性和作用机理，为进一步开发、应用灵芝孢子的有效成份提供线索和依据。 研究目的 1.探讨灵芝孢子粉对LPS所致的PD大鼠模型的保护作用 2.研究灵孢多糖对LPS诱导的原代多巴胺能神经元变性的保护作用及相关机制。 3.研究灵孢多糖对MPP+损伤PC12细胞的保护作用。 方法和结果 第一部分在体研究灵芝孢子粉对LPS所致PD大鼠的保护作用 方法 1.LPS诱导PD动物模型的制作 2.动物分组 对照组：脑立体定向手术右侧黑质注射PBS。 LPS模型组：脑立体定向手术向右侧注射20μgLPS(LPS浓度为5mg/ml)。 LPS+灵芝孢予粉组：先用灵芝孢子粉灌胃3天，立体定向注射LPS，继续灌胃14天，直至处死。 3.动物行为学观察4.TH、OX-42、TNF-α及iNOS染色结果观察 5.RT-PCR检测TH、TNF-α及iNOSmRNA的表达量 结果 1.动物行为学观察 正常对照组未出现旋转行为。LPS组30min旋转次数为(125±12)r，LPS+灵芝孢子粉组30min旋转次数为(94±3)r，两组比较差别有显著性意义(p＜0.01)。 2.免疫组化法检测灵芝孢子粉对TH表达的影响 各组均检测到TH的阳性细胞表达，正常对照组存活的TH阳性细胞数最多，LPS+灵芝孢子粉组有所减少，LPS组存活的TH阳性细胞数量较前两组均减少，两处理组阳性细胞差异有统计学意义(P＜0.01)。3.OX-42染色结果 正常对照组Mic呈现典型的“分枝样”，LPS注入黑质14d后大部分Mic活化，胞体增大，突起变短，增粗，细胞数量明显增多。灵芝孢子粉+LPS组中的Mic数目较单纯LPS组明显减少，视野中有“分枝样”Mic。4.免疫组化检测PD大鼠黑质TNF-α及iNOS的表达 正常对照组可见少量TNF-α和iNOS阳性细胞的表达，LPS处理后的两组可见TNF-α及iNOS阳性细胞表达均明显增多，组间比较可见单纯LPS组的TNF-α及iNOS阳性细胞增多程度高于灵芝孢子粉+LPS组(P＜0.01)。 5.RT-PCR检测PD大鼠术侧中脑TH、TNF-α和iNOSmRNA表达 在正常对照组中有较多量的THmRNA表达，TNF-α及iNOSmRNA有少量表达，LPS处理后的两组可见THmRNA表达减少，而TNF-α和iNOSmRNA的表达量则明显升高，在LPS+灵芝孢子组中其THmRNA表达量较LPS组的表达量增多，TNF-α和iNOSmRNA的表达低于LPS组，各组间比较有显著性差异(p＜0.01) 第二部分体外研究灵孢多糖对DA能神经元的保护作用及相关机制 方法 1.LPS诱导DA能神经元损伤细胞模型的建立在乳鼠原代中脑神经元和神经胶质细胞共培养基础上，待细胞生长6至7天后，选取每孔密度大约是6×105个的细胞，随机分为6组，换用新鲜培养基，每孔培养液为2mL，同时加入不同干预因素，每组样本至少为5个，作用时间为24小时。 正常对照组：DMEM细胞培养液培养。单纯GLPS组：不加LPS，而加入GLPS，终浓度为300μg/mL。LPS组：加入LPS使其终浓度为20ng/mL。GLPS预处理组3组：在加入终浓度20ng/mL的LPS之前30min加入GLPS，终浓度分别为50，100，300μg/mL。 2.免疫组化检测TH、OX-42、TNF-α和iNOS阳性细胞的表达。 3.RT-PCR检测TH、TNF-α及iNOSmRNA的表达含量。 结果 1.免疫组化检测GLPS对TH细胞及小胶质细胞激活和数量的影响。在正常未予干预的共培养体系中具有较多的TH阳性细胞的表达，LPS处理后，TH阳性细胞数明显减少，但在LPS+GLPS100μg/mL及LPS+GLPS300μg/mL组中，TH阳性细胞数量较单纯LPS组明显增多，对照组Mic体积较小，为分枝状，数量也较LPS组减少，在GLPS300μg/mL组中，未发现激活的小胶质细胞，Mic总数量也较LPS组明显减少，说明GLPS对小胶质细胞没有激活作用。LPS组，LPS诱导前的Mic体积较小，LPS诱导后细胞体积明显增大，为圆形或吞噬状，数量明显增多。LPS+GLPS50μg/mL中Mic大部分被激活，其激活的Mic数量及Mic总量上与LPS组无明显差异。但在LPS+GLPS100μg/mL及LPS+GLPS300μg/mL组中，激活的小胶质细胞明显被抑制，细胞总数较LPS组明显下降。 2.免疫组化检测共培养体系中TNF-α，iNOS的阳性细胞表达 在正常未予干预的共培养体系中仅有少量的TNF-α，iNOS阳性细胞表达，LPS处理后，TNF-α，iNOS阳性细胞数明显增多，经不同剂量的GLPS(100μg/mL和300μg/mL)处理后，TNF-α，iNOS阳性细胞数较LPS组明显下降(P＜0.01) 3.RT-PCR检测TH，TNF-α和iNOSmRNA的表达 对照组和GLPS300μg/mL组中有少量的TNF-αmRNA，iNOSmRNA表达，THmRNA的表达量较高。LPS处理24h后，TNF-αmRNA，iNOSmRNA表达则明显增多，THmRNA的表达量明显减少，LPS+GLPS50μg/mL中TNF-αmRNA，iNOSmRNA表达量较LPS组的表达量稍低，但无统计学意义(P＞0.05)，LPS+GLPS100μg/mL及LPS+GLPS300μg/mL中TNF-αmRNA、iNOSmRNA表达量较LPS组的表达量明显降低，而THmRNA的表达量较LPS组的表达量明显增高(P＜0.01)。 第三部分灵孢多糖对MPP+损伤PC12细胞的保护作用 方法 1.分组 空白对照组：在细胞培养体系中不加入任何药物；单纯GLPS处理组：在细胞培养体系中加入300μg/mlGLPS；Mpp+处理组：在细胞培养体系中加入MPP+； GLPS+MPP+处理组：在细胞培养体系中加入GLPS预处理30min，再加入MPP+继续处理48h,GLPS终浓度分别为100μg/ml、200μg/ml及300μg/ml。 2.细胞活力测定(MTT法)。 3.LDH水平检测。 4.免疫组化检测TH表达。 结果 1.MTT法检测的PC12细胞活力的变化不同剂量MPP+(0-1mm/L)处理后24h，细胞活力逐渐下降，呈剂量-依赖关系。单纯GLPS处理48h后，细胞活力与对照组比较无明显差异，说明单纯的GLPS处理对PC12细胞活力没有明显影响。单纯Mpp+(0.4mm/L)处理48h后，细胞活力明显下降，为对照组的52.14％，在Mpp+(0.4mm/L)处理前30min加入不同剂量的GLPS(100、200和300μg/ml)后，细胞活力较单纯MPP+处理组的细胞活力有明显的提高，分别为65.41％，75.42％，78.54％。 2.LDH检测：单纯的GLPS处理48h后，细胞中的LDH活性较对照组无明显差异，说明GLPS对PC12无毒性作用。MPP+处理48h后，上清中LDH水平较对照组明显增加，经不同浓度的GLPS预处理后，上清中的LDH水平较MPP+组明显下降。 3.TH免疫组化检测 在对照组及GLPS单纯组有较多的TH阳性细胞的表达，MPP+处理后，TH阳性细胞数明显减少，表达强度减弱。但在MPP++GLPS300μg/mL组中，TH阳性细胞数量较单纯LPS组明显增多。 结论 1.灵芝孢子能有效地降低LPS诱导的PD大鼠模型行为学改变的发生，减少SNpc的DA能神经元的损伤。 2.研究发现灵孢多糖对于LPS诱导损伤的DA能神经元具有保护作用。 3.灵孢多糖可抑制Mic的激活，减少iNOS及TNF-α的表达，从而起到保护DA能神经元的作用。 4.灵孢多糖对MPP+损伤PC12细胞具有保护作用。