论文部分内容阅读
杭白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat cv‘Hangbaiju’）是著名的“浙八味”中药材之一，花朵富含药理和营养成分。本研究以两个杭白菊主栽品种早小洋菊（C.morifolium cv.Zaoxiaoyangju）和晚小洋菊（C.morifolium cv.Wanxiaoyangju）为试验材料，测定了从营养生长至盛花期间5种内源激素含量变化及其相关基因表达量的动态，分析了花芽分化和花器官发育期间顶端、茎段和叶片三个部位的内源激素变化、运输和作用。接着克隆、鉴定了与开花密切关联的9个CmPEBP基因家族成员，并进行生物信息学分析和组织特异性检测。同时，在温度胁迫、光处理和暗处理条件下，用7种激素处理后，检测CmPEBP基因家族中7个成员在转录水平的表达模式。主要研究内容及结果如下：
（1）使用HPLC对杭白菊5种内源激素在开花期间的含量变化进行分析，使用qRT-PCR技术检测杭白菊5种内源激素相关基因在开花期的表达情况。研究发现，在不同品种杭白菊、不同发育阶段中，5种内源激素及其5个相关基因的表达水平有着较大差异。花芽分化期间，在晚小洋菊顶端、茎段和叶片3个部位中赤霉素（gibberllins，GA）的含量始终高于早小洋菊相应器官中的含量，在两个品种杭白菊的顶端、茎段和叶片中分别呈现上升、不变和下降的趋势，而CmGA20ox的表达量在此期间均呈现上调的趋势。因此推测在花芽分化期存在着GA在叶片中合成后向顶端富集的现象。晚小洋菊顶端部位的脱落酸（abscisic acid，ABA）含量在花芽分化期间急剧升高，两个品种间ABA含量在花芽分化期和花器官发育前期差异显著；生长素（auxin，IAA）在3个部位中一直处于较高水平的波动状态，检测发现未分化期顶端中IAA含量急剧上升，在花器官发育阶段含量下降，而茎段部位IAA含量变化趋势相反，且茎段YUC的表达水平未发现显著变化，因此推测IAA在花芽分化完成之后，可能存在向下运输的过程。由此可见GA、ABA和IAA在杭白菊成花过程中起着独特的作用，适宜浓度的GA、ABA和IAA可促进菊花的花芽分化和花器官发育，高浓度ABA可使胞间连丝闭合阻碍IAA的输出和GA输入，这可能是延迟晚小洋菊开花的最主要因素。
（2）以已知的14个植物物种基因作为参考，从杭白菊转录组数据库中，共鉴定出9个CmPEBP基因家族成员，利用生物信息学手段进行系统发育分析和motif联合分析。根据CmPEBP蛋白序列与拟南芥PEBP蛋白序列的亲缘远近进行命名。杭白菊PEBP基因家族包括3个CmFT、2个CmMFT和4个CmTFL基因，分别归属3个分组5个类群。蛋白序列平均长度为173个氨基酸，预测蛋白的分子量为18.45-20.98kDa，理论等电点（pI）从4.71（CmMFT1）到9.54（CmTFL2）不等，亚细胞定位预测多位于细胞质与细胞核。qRT-PCR分析组织特异性表达，发现CmTFL3与大豆GmTFL1的表达模式类似，在幼根、幼茎中表达较高。CmTFL4在营养生长期的叶组织、叶柄组织和顶端组织中表达量最高，CmMFT1在营养生长期和开花期的根组织中表达水平最低。
（3）利用qRT-PCR技术比较分析了在光处理和暗处理条件下，7个CmPEBP基因在应对外源激素处理时的表达模式。结果发现7种不同的外源激素对CmPEBP的表达具有不同的影响，IAA能抑制CmTFL1的基因表达；6-苄氨基腺嘌呤（Benzylaminopurine，BA）BA能促进CmTFL1和CmTFL3的基因表达；ABA能促进CmFT2、CmFT3、CmTFL1、CmTFL2基因表达；乙烯（ethylene，ET）能促进CmFT2、CmFT3、CmTFL2和CmTFL3的基因表达；水杨酸（Salicylic acid，SA）能抑制CmTFL3的基因表达；茉莉酸甲酯（Methyl jasmonicacid，MeJA）能促进CmFT2、CmFT3、CmTFL1和CmTFL2的表达。水杨酸甲酯（Methyl salicylate，MeSA）能抑制CmTFL3的基因表达，促进CmTFL2的基因表达。而基因CmMFT1在两个处理组中，能被7种激素促进其表达。温度胁迫也会影响CmPEBP基因的表达：低温（4℃）抑制了CmFT1、CmFT2、CmFT3的表达，不同程度地促进CmMFT1和CmTFL1、CmTFL2和CmTFL3的表达；高温（38℃）条件则不同程度地促进了4个CmPEBP基因（CmFT2、CmMFT1、CmTFL1、CmTFL2）的表达。其中CmMFT1基因表达的上调幅度最大。
本研究揭示了相关内源激素对杭白菊开花进程的影响，明确了杭白菊成花关联基因CmPEBP家族在激素处理下的表达特征，可为深化杭白菊开花机理的研究提供参考。
（1）使用HPLC对杭白菊5种内源激素在开花期间的含量变化进行分析，使用qRT-PCR技术检测杭白菊5种内源激素相关基因在开花期的表达情况。研究发现，在不同品种杭白菊、不同发育阶段中，5种内源激素及其5个相关基因的表达水平有着较大差异。花芽分化期间，在晚小洋菊顶端、茎段和叶片3个部位中赤霉素（gibberllins，GA）的含量始终高于早小洋菊相应器官中的含量，在两个品种杭白菊的顶端、茎段和叶片中分别呈现上升、不变和下降的趋势，而CmGA20ox的表达量在此期间均呈现上调的趋势。因此推测在花芽分化期存在着GA在叶片中合成后向顶端富集的现象。晚小洋菊顶端部位的脱落酸（abscisic acid，ABA）含量在花芽分化期间急剧升高，两个品种间ABA含量在花芽分化期和花器官发育前期差异显著；生长素（auxin，IAA）在3个部位中一直处于较高水平的波动状态，检测发现未分化期顶端中IAA含量急剧上升，在花器官发育阶段含量下降，而茎段部位IAA含量变化趋势相反，且茎段YUC的表达水平未发现显著变化，因此推测IAA在花芽分化完成之后，可能存在向下运输的过程。由此可见GA、ABA和IAA在杭白菊成花过程中起着独特的作用，适宜浓度的GA、ABA和IAA可促进菊花的花芽分化和花器官发育，高浓度ABA可使胞间连丝闭合阻碍IAA的输出和GA输入，这可能是延迟晚小洋菊开花的最主要因素。
（2）以已知的14个植物物种基因作为参考，从杭白菊转录组数据库中，共鉴定出9个CmPEBP基因家族成员，利用生物信息学手段进行系统发育分析和motif联合分析。根据CmPEBP蛋白序列与拟南芥PEBP蛋白序列的亲缘远近进行命名。杭白菊PEBP基因家族包括3个CmFT、2个CmMFT和4个CmTFL基因，分别归属3个分组5个类群。蛋白序列平均长度为173个氨基酸，预测蛋白的分子量为18.45-20.98kDa，理论等电点（pI）从4.71（CmMFT1）到9.54（CmTFL2）不等，亚细胞定位预测多位于细胞质与细胞核。qRT-PCR分析组织特异性表达，发现CmTFL3与大豆GmTFL1的表达模式类似，在幼根、幼茎中表达较高。CmTFL4在营养生长期的叶组织、叶柄组织和顶端组织中表达量最高，CmMFT1在营养生长期和开花期的根组织中表达水平最低。
（3）利用qRT-PCR技术比较分析了在光处理和暗处理条件下，7个CmPEBP基因在应对外源激素处理时的表达模式。结果发现7种不同的外源激素对CmPEBP的表达具有不同的影响，IAA能抑制CmTFL1的基因表达；6-苄氨基腺嘌呤（Benzylaminopurine，BA）BA能促进CmTFL1和CmTFL3的基因表达；ABA能促进CmFT2、CmFT3、CmTFL1、CmTFL2基因表达；乙烯（ethylene，ET）能促进CmFT2、CmFT3、CmTFL2和CmTFL3的基因表达；水杨酸（Salicylic acid，SA）能抑制CmTFL3的基因表达；茉莉酸甲酯（Methyl jasmonicacid，MeJA）能促进CmFT2、CmFT3、CmTFL1和CmTFL2的表达。水杨酸甲酯（Methyl salicylate，MeSA）能抑制CmTFL3的基因表达，促进CmTFL2的基因表达。而基因CmMFT1在两个处理组中，能被7种激素促进其表达。温度胁迫也会影响CmPEBP基因的表达：低温（4℃）抑制了CmFT1、CmFT2、CmFT3的表达，不同程度地促进CmMFT1和CmTFL1、CmTFL2和CmTFL3的表达；高温（38℃）条件则不同程度地促进了4个CmPEBP基因（CmFT2、CmMFT1、CmTFL1、CmTFL2）的表达。其中CmMFT1基因表达的上调幅度最大。
本研究揭示了相关内源激素对杭白菊开花进程的影响，明确了杭白菊成花关联基因CmPEBP家族在激素处理下的表达特征，可为深化杭白菊开花机理的研究提供参考。