基于交叉引物等温扩增的掺假肉检测技术研究

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肉类掺假现象时有发生,严重损害消费者利益,同时还有可能引起伦理或宗教信仰等敏感问题。建立快速可靠的肉类真实性鉴定方法,可为规范市场秩序提供检测技术支撑,具有实际意义。本文以狐狸、牛、羊、猪、鸭、驴和鼠肉以及模拟掺假样本为研究对象,结合交叉引物等温扩增技术(Cross-primer isothermal amplification,CPA)和胶体金核酸试纸条检测技术,就DNA快速提取技术、设计封闭式恒温扩增及检测装置、单独源性成分快速检测以及多种肉类同步快速检测四个方面开展研究。旨在建立一种快速简便的动物源性掺假肉鉴定方法。主要研究结果如下:
  1.在动物DNA酚-氯仿提取方法上进行试剂、设备和操作的简化,提出了适用等温扩增快速检测需求的样品前处理方法,并以羊特异性CPA扩增体系结合电泳检测方式对快速提取DNA进行检测验证。结果表明:简化方案肉样本取样量从0.1g增加至5.0g,更具代表性,所用提取试剂仅为3种,提取步骤为4步,提取时间约为30min,仪器简单便携,快速提取的羊DNA能满足CPA扩增及特异性检出;快速提取的羊和狐狸肉掺假混合肉DNA的检测限为9%。
  2.设计了集等温扩增与胶体金核酸试纸条检测为一体的简易装置,操作简单,体积小,通过倒置即可用肉眼观察结果,减少了气溶胶污染造成的假阳性。通过羊特异性CPA检测体系测试装置有效,相比于暴露的试纸条检测污染率降低了19%,结合DNA快速提取方法能实现交叉引物等温扩增技术在肉掺假快速检测中的应用。
  3.根据狐狸特异性DNA区段设计CPA引物体系并进行优化筛选分析,建立了CPA扩增体系与胶体金核酸试纸条相结合的有效检测技术,能快速区分狐狸与驴、羊、猪、牛、鸭和鼠肉,灵敏度为10ng?μL-1,对羊和狐狸肉混合肉的快速提取DNA狐成分检测限为1%,结合DNA快速提取方法和封闭式恒温扩增及检测装置能实现狐狸源性成分快速检测。
  4.利用一套通用引物体系结合特异性外加标记引物和巧妙转换CPA引物标记方式,建立了多个物种成分的交叉引物等温扩增结合胶体金核酸试纸条快速检测技术。以驴、羊和狐狸3种肉类的CPA通用引物体系检测实验验证了方法的可行性并进行了优化,以牛、羊、狐狸和猪4种肉类的鉴定实验进一步验证了方法的有效性,灵敏度为0.1ng?μL-1,多种肉混合DNA仍能特异检出,对羊和狐狸肉混合肉DNA中狐狸成分检测限为1%。并实现了以双检测线的胶体金核酸试纸条同步检测猪和狐狸两种肉类。
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