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茭白（Zizania latifolia(Griseb.)Stapf）孕茭是菰黑粉菌（Ustilago esculenta P.Henn.）侵染茭白植株后茎部膨大形成病态器官的结果，菰黑粉菌以活体营养型方式寄生在茭白植株内。水杨酸（SA）合成及其信号传导可能是调节茭白植株与菰黑粉菌互作共生的重要途径。本文通过SA相关激素外源处理，结合田间孕茭生产的调查分析，明确了SA对茭白孕茭生产的影响；结合植株生长与茎部菰黑粉菌菌丝分布及菌量变化的比较分析，阐明了SA对茭白植株与菰黑粉菌互作共生的调节作用；克隆茭白植株SA合成关键基因——Zl-PAL1，阐明了SA合成基因在茭白植株生长及茎部膨大发育中的表达变化，结合外源激素对茭白SA合成及其信号传导关键基因的表达调节分析，探讨了SA调节茭白植株与菰黑粉菌互作共生的可能机制。此外，构建了茭白Zl-PAL1过表达遗传转化载体，基于烟草瞬时表达明确了Zl-PAL1的亚细胞定位，筛选获得了茭白Zl-PAL1过表达遗传转化阳性植株，为后续茭白SA合成基因功能验证分析奠定基础。主要结果如下：
一、SA对茭白田间孕茭生产的调节作用
采用SA结构类似物BTH及茉莉酸甲酯（MeJA）处理田间茭白植株，结合田间植物学及经济学性状的调查表明，SA对茭白田间生产的采收期及产量具有显著调节作用。BTH处理可以使茭白采收集中在采收前期，并提高田间茭白总产量，对茭白品质没有影响。MeJA处理导致茭白采收延迟，高浓度（20mM）处理会使膨大茎部提前老化，茭白品质下降。田间植物学性状调查发现：BTH处理能够促进茭白株高增长，但MeJA处理对茭白株高具有显著的抑制作用；BTH对茭白叶长和叶宽没有显著影响，而MeJA处理后茭白叶长均下降，高浓度（20mM）抑制作用显著。经济学性状分析表明：BTH能够促进茭白肉质茎生长，而MeJA可以抑制肉质茎生长，高浓度处理后茎长与茎宽均显著减少，SA可能通过影响茭白植株茎部菰黑粉菌菌丝生长，进而调节茭白茎部孕茭起始及后续的膨大发育。
二、SA对茭白苗期植株与菰黑粉菌互作共生的调节分析
采用BTH/MeJA处理苗期茭白植株48h后，20mM BTH处理不影响正常茭植株生长，但20mM MeJA处理后，正常茭植株生长发育显著迟缓，叶片及茎部发黄，呈现明显的病态。BTH/MeJA处理对野茭植株生长没有影响。处理48h后茭白茎部的菌量检测发现，BTH处理后，正常茭茎部菌量显著降低（P＜0.05），MeJA处理后茎部菌量显著增加（P<0.05）；而野茭中未检测到菰黑粉菌存在，激素处理后未见变化。菰黑粉菌菌丝的WGA荧光染色观察发现，BTH处理可以抑制正常茭茎部菰黑粉菌菌丝的生长，茎部菰黑粉菌菌丝簇数量较对照明显下降，菌丝簇生长受到显著抑制；MeJA处理后，正常茭白茎部菰黑粉菌菌丝簇大量增加，菌丝生长显著增强。SA可以通过影响茎部菰黑粉菌菌丝生长调节茭白植株与菰黑粉菌的互作共生。
三、Zl-PAL1基因全长克隆
克隆获得茭白Zl-PAL1基因的全长序列。Zl-PAL1基因组全长2142bp，不含内含子，编码713个氨基酸。结构域预测发现其有苯丙氨酸解氨酶（PIN00457）保守结构域，属于PAL基因家族。进一步预测发现其蛋白分子量为76.75kDa,PI为5.93,该蛋白较稳定。二级结构主要为α-螺旋和无规卷曲，通过同源建模的方法预测其三级结构发现，Zl-PAL1由同源四聚体组成，与已报道其他物种PAL1蛋白相同，不具有信号肽结构，对其进行亚细胞定位预测发现其位于细胞质基质，不存在跨膜区。系统进化分析发现，Zl-PAL1与二穗短柄草聚为一类，表明其与二穗短柄草在进化上关系较近。
四、SA合成基因的表达模式分析
茭白三个孕茭表型间SA合成相关基因（Zl-PAL1及Zl-ICS1）的表达分析发现：孕茭前（5叶期）茎部，野茭茎部2个SA合成基因表达量均显著高于正常茭与灰茭，SA合成基因表达下调与茎部菰黑粉菌定殖及菌丝生长相关。孕茭起始（8叶期）茎部，正常茭与灰茭中表达趋势相同，野茭中Zl-ICS1表达显著下降，而Zl-PAL1仍保持高表达，Zl-PAL1对茭白SA合成可能具有更重要的调节作用，正常茭中Zl-PAL1的低表达能够为菰黑粉菌菌丝大量增殖创造有利条件，进而诱导茎部起始膨大。正常茭茎部膨大发育期间Zl-PAL1表达随发育期逐渐升高，灰茭中Zl-PAL1表达先升后降，可能与两种膨大表型茎部菰黑粉菌菌丝生长状态相关（灰茭中孢子产生）；灰茭茎部膨大发育期间Zl-ICS1表达无显著差异，正常茭白茎部中呈增加趋势，但不同时期表达的变化量显著低于Zl-PAL1。茭白植株中SA合成基因的表达响应不同，Zl-PAL1表达可能与茭白茎部孕茭发育调节相关，而Zl-ICS1表达与茎部菰黑粉菌菌丝生长诱导相关。
BTH/MeJA处理正常茭白苗期植株的基因表达发现：20mM BTH处理后，与对照相比，Zl-PAL1及Zl-ICS1表达均显著上调（P＜0.01）；20mM MeJA处理后Zl-PAL1表达上调，Zl-ICS1表达下调。BTH处理后，正常茭白植株茎部Zl-NPR1、Zl-TGA2、Zl-TGA4及Zl-PR1表达均显著上调；而经MeJA处理后，Zl-NPR1、Zl-TGA2、Zl-TGA4及Zl-PR1均显著下调，且变化趋势一致。
五、Zl-PAL1基因过表达载体构建及转基因阳性植株获得
构建过表达遗传转化载体pFGC-Egfp-Zl-PAL1，采用农杆菌介导方法在烟草叶片中进行瞬时表达分析，GFP荧光信号显微镜观察表明，Zl-PAL1蛋白定位在叶肉细胞的细胞质基质中，与预测结果一致。qPCR定量检测发现：Zl-PAL1基因在转基因烟草叶片中表达量显著升高；采用农杆菌介导的苗端生长点转化法转化茭白无菌苗，获得茭白Zl-PAL1过表达转基因植株。
一、SA对茭白田间孕茭生产的调节作用
采用SA结构类似物BTH及茉莉酸甲酯（MeJA）处理田间茭白植株，结合田间植物学及经济学性状的调查表明，SA对茭白田间生产的采收期及产量具有显著调节作用。BTH处理可以使茭白采收集中在采收前期，并提高田间茭白总产量，对茭白品质没有影响。MeJA处理导致茭白采收延迟，高浓度（20mM）处理会使膨大茎部提前老化，茭白品质下降。田间植物学性状调查发现：BTH处理能够促进茭白株高增长，但MeJA处理对茭白株高具有显著的抑制作用；BTH对茭白叶长和叶宽没有显著影响，而MeJA处理后茭白叶长均下降，高浓度（20mM）抑制作用显著。经济学性状分析表明：BTH能够促进茭白肉质茎生长，而MeJA可以抑制肉质茎生长，高浓度处理后茎长与茎宽均显著减少，SA可能通过影响茭白植株茎部菰黑粉菌菌丝生长，进而调节茭白茎部孕茭起始及后续的膨大发育。
二、SA对茭白苗期植株与菰黑粉菌互作共生的调节分析
采用BTH/MeJA处理苗期茭白植株48h后，20mM BTH处理不影响正常茭植株生长，但20mM MeJA处理后，正常茭植株生长发育显著迟缓，叶片及茎部发黄，呈现明显的病态。BTH/MeJA处理对野茭植株生长没有影响。处理48h后茭白茎部的菌量检测发现，BTH处理后，正常茭茎部菌量显著降低（P＜0.05），MeJA处理后茎部菌量显著增加（P<0.05）；而野茭中未检测到菰黑粉菌存在，激素处理后未见变化。菰黑粉菌菌丝的WGA荧光染色观察发现，BTH处理可以抑制正常茭茎部菰黑粉菌菌丝的生长，茎部菰黑粉菌菌丝簇数量较对照明显下降，菌丝簇生长受到显著抑制；MeJA处理后，正常茭白茎部菰黑粉菌菌丝簇大量增加，菌丝生长显著增强。SA可以通过影响茎部菰黑粉菌菌丝生长调节茭白植株与菰黑粉菌的互作共生。
三、Zl-PAL1基因全长克隆
克隆获得茭白Zl-PAL1基因的全长序列。Zl-PAL1基因组全长2142bp，不含内含子，编码713个氨基酸。结构域预测发现其有苯丙氨酸解氨酶（PIN00457）保守结构域，属于PAL基因家族。进一步预测发现其蛋白分子量为76.75kDa,PI为5.93,该蛋白较稳定。二级结构主要为α-螺旋和无规卷曲，通过同源建模的方法预测其三级结构发现，Zl-PAL1由同源四聚体组成，与已报道其他物种PAL1蛋白相同，不具有信号肽结构，对其进行亚细胞定位预测发现其位于细胞质基质，不存在跨膜区。系统进化分析发现，Zl-PAL1与二穗短柄草聚为一类，表明其与二穗短柄草在进化上关系较近。
四、SA合成基因的表达模式分析
茭白三个孕茭表型间SA合成相关基因（Zl-PAL1及Zl-ICS1）的表达分析发现：孕茭前（5叶期）茎部，野茭茎部2个SA合成基因表达量均显著高于正常茭与灰茭，SA合成基因表达下调与茎部菰黑粉菌定殖及菌丝生长相关。孕茭起始（8叶期）茎部，正常茭与灰茭中表达趋势相同，野茭中Zl-ICS1表达显著下降，而Zl-PAL1仍保持高表达，Zl-PAL1对茭白SA合成可能具有更重要的调节作用，正常茭中Zl-PAL1的低表达能够为菰黑粉菌菌丝大量增殖创造有利条件，进而诱导茎部起始膨大。正常茭茎部膨大发育期间Zl-PAL1表达随发育期逐渐升高，灰茭中Zl-PAL1表达先升后降，可能与两种膨大表型茎部菰黑粉菌菌丝生长状态相关（灰茭中孢子产生）；灰茭茎部膨大发育期间Zl-ICS1表达无显著差异，正常茭白茎部中呈增加趋势，但不同时期表达的变化量显著低于Zl-PAL1。茭白植株中SA合成基因的表达响应不同，Zl-PAL1表达可能与茭白茎部孕茭发育调节相关，而Zl-ICS1表达与茎部菰黑粉菌菌丝生长诱导相关。
BTH/MeJA处理正常茭白苗期植株的基因表达发现：20mM BTH处理后，与对照相比，Zl-PAL1及Zl-ICS1表达均显著上调（P＜0.01）；20mM MeJA处理后Zl-PAL1表达上调，Zl-ICS1表达下调。BTH处理后，正常茭白植株茎部Zl-NPR1、Zl-TGA2、Zl-TGA4及Zl-PR1表达均显著上调；而经MeJA处理后，Zl-NPR1、Zl-TGA2、Zl-TGA4及Zl-PR1均显著下调，且变化趋势一致。
五、Zl-PAL1基因过表达载体构建及转基因阳性植株获得
构建过表达遗传转化载体pFGC-Egfp-Zl-PAL1，采用农杆菌介导方法在烟草叶片中进行瞬时表达分析，GFP荧光信号显微镜观察表明，Zl-PAL1蛋白定位在叶肉细胞的细胞质基质中，与预测结果一致。qPCR定量检测发现：Zl-PAL1基因在转基因烟草叶片中表达量显著升高；采用农杆菌介导的苗端生长点转化法转化茭白无菌苗，获得茭白Zl-PAL1过表达转基因植株。