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木薯(Manihho esculenta Crantz)是一种重要的热带块根类经济作物,其产量与块根的大小、数目、及淀粉含量密切相关,并受生物和非生物胁迫的影响。单糖转运蛋白(Sugar Transport Protein,STP)是植物体内负责转运单糖的蛋白,参与植物的组织发育和胁迫响应。解析MeSTPs参与木薯块根发育及适应低温胁迫的潜在机理,可为后续木薯块根性状的遗传改良及抗寒的选育提供理论依据。本研究以木薯Kasetsart University 50(KU50)为实验材料,首先剖析了木薯块根的发育进程和低温胁迫下的生理变化,在此基础上,利用Real-time PCR技术筛选出在块根形成早期高表达且受低温诱导上调表达的单糖转运蛋白基因MeSTP17、MeSTP19,并克隆了 cDNA全长,再通过酵母突变体功能回补实验和利用亚细胞定位技术剖析了其转运特性及亚细胞定位,最后通过转基因的方法,以深入研究上述两个基因在植物根系发育和低温胁迫中的功能。主要结果如下:(1)观察并统计分析了木薯植后10天到203天根系的发育进程。发现木薯初生须根在生长过程中,大部分退化消失,少部分逐渐发育为成熟的块根。根的总数目在植后初期先增多,植后45天逐渐减少;根的总长度在植后初期先升高,植后45天降低;根的直径在植后45天开始急剧增大;块根数目在植后45天开始逐渐增加,增加到10到11条保持相对稳定。在植后45天的根系中存在初生须根、次生须根、膨大根(块根)以及在局部膨大的同一条根不同的生长区包括膨大区(块根),次生区和初生区,表明木薯植后45天根系发育正处在块根形成早期,根的形态正在发生变化。(2)解析了木薯植后45天根系中酸性转化酶与蔗糖合酶的活性变化,以及糖分含量变化。发现细胞壁酸性转化酶活性:初生须根>次生须根>膨大根(块根),初生区>次生区>膨大区(块根);细胞内可溶性酸性转化酶活性:初生须根>次生须根>膨大根,初生区<膨大区(块根)<次生区;蔗糖合酶活性.:初生须根<次生须根<膨大根,初生区<膨大区(块根)<次生区;果糖、葡萄糖和蔗糖含量均是:初生须根<次生须根<膨大根,初生区<次生区<膨大区(块根);以上结果暗示了在木薯块根形成过程中糖类卸载途径发生了转换,并需要更多的糖类物质参与。(3)分析了木薯MeSTPs基因家族成员在植后45天根系中的表达模式。发现初生须根、次生须根和膨大根中MeSTP17、MeSTP19相对表达量显著高于其它成员。在局部膨大的同一条根的不同生长区中MeSTP17、MeSTP19相对表达量也显著高于其它成员。在木薯块根发育不同时期,MeSTP17、MeSTP19相对表达量均是在木薯块根的发育早期比较高,之后逐渐下降。以上结果暗示了 MeSTP17和MeSTP19可能参与了木薯块根的早期发育。(4)观察并分析了在7℃低温胁迫下,木薯植株在0h、6h、9h、30h的形态与生理变化。发现随着低温胁迫时间的延长,木薯植株从尖芽饱满,成熟叶片生长挺拔逐渐出现成熟叶片软化、叶柄向下弯曲丧失力量,嫩茎和嫩叶萎蔫等明显的形态损伤;木薯叶片相对电导率逐渐升高;MDA浓度在6h后略有下降,但在9h时增加,在30 h,MDA浓度水平提高两倍多。木薯叶片的的叶绿素含量逐渐降低而可溶性糖含量逐渐增加;果糖含量在6 h之后迅速升高;葡萄糖糖含量先降低,在30 h时上升;蔗糖含量逐渐升高。以上结果表明低温胁迫破坏了木薯叶片细胞质膜,阻碍了光合作用使糖类物质的合成受阻,引起糖代谢变化。(5)进行了木薯MeSTPs基因家族成员在低温胁迫下的表达模式分析。在7℃低温胁迫下,木薯MeSTPs在Oh、6 h、9 h、30 h的表达量出现不同程度的变化,其中MeSTP17与MeSTP19的表达波动幅度较大,MeSTP17的表达量先上调后下调,在9 h上调到78.8,而MeSTP19表达量一直上调,在30 h达到21.7;其它基因的表达量无显著变化。以上结果初步确定MeSTP17、MeSTP19参与了木薯对低温胁迫的响应。(6)利用酵母突变体功能回补实验和亚细胞定位技术,探究了MeSTP 的转运特性。在酵母单糖转运蛋白突变体上对MeSTP17、MeSTP19进行功能互补实验,结果表明:MeSTP17、MeSTP19除木糖外,对葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖均有比较强的转运能力,具有广谱的单糖转运特性,并对解偶联剂CCCP表现敏感,其转运作用依赖于H+-ATP所建立的跨膜质子动力势。通过酵母异源表达系统,拟南芥与木薯原生质体瞬时表达体系进行亚细胞定位分析,发现单糖转运蛋白MeSTP17、MeSTP19定位于细胞膜。以上结果证明了 MeSTP17、MeSTP19是具有广谱单糖转运特性并定位于细胞膜的单糖转运蛋白。(7)构建了MeSTP17 MeSTP19植物过表达载体,转入拟南芥,获得拟南芥转化苗T2代株系数目分别为19和21。综上所述,木薯的单糖转运蛋白基因MeSTP17、MeSTP19,在木薯块根形成早期高表达,同时响应低温胁迫;定位于细胞膜,对不同的单糖底物有广谱的转运特性。推测MeSTP17、19主要参与木薯块根的早期发育,影响到根系的形态建成同时响应低温胁迫。