论文部分内容阅读
CCN3是表达于体内多种组织器官中的细胞外分泌蛋白,参与调节细胞粘附、有丝分裂等诸多生物过程。近年来研究发现CCN3的表达与骨形成和发育密切相关。有研究显示CCN3可作为分泌型配体,与Notch1结合,参与信号传导。前期研究发现CCN3参与调控Notch,从而抑制BMPs引起的间充质干细胞的成骨分化。由于细胞分化和细胞增殖,在细胞发育过程中密切相关,CCN3抑制MSCs分化,那么它的功能是否主要在促进细胞增殖方面呢?而现有关于CCN3调控细胞增殖的研究较少,且现有研究结论不一致,机制不明确。小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为MSCs研究模型被越来越多的运用在MSCs相关研究中。本研究以MEFs作为MSCs研究模型,采用重组腺病毒过表达及敲减CCN3,了解CCN3对细胞存活的影响,并探讨其潜在机制,本研究结果将丰富调控MSCs生长发育机制的基础研究结果,还可为解决骨组织工程中的种子细胞来源问题提供一些新的解决思路。第一部分:目的:探究CCN3对MSCs存活（增殖、凋亡和迁移）的作用。方法:采用小鼠成纤维细胞MEFs作为MSCs研究模型,采用重组腺病毒过表达及下调CCN3。采用流式细胞术、CCK-8、Hoechst检测CCN3等对增殖和凋亡影响;Trans Well实验检测CCN3对细胞迁移的影响;Western Blot检测细胞内增殖标志蛋白PCNA、细胞周期蛋白Cyclin E、Cyclin B1、促凋亡蛋白Bax、抑凋亡蛋白Bcl-2、细胞迁移标志蛋白Snail、Vimentin、Twist表达变化的影响;采用q RT-PCR探究对BMPs mRNA表达量的影响。结果:CCK-8、流式细胞术、Hoechst和Trans Well实验结果显示:与GFP对照组比较,过表达CCN3可促进MEFs增殖和迁移,抑制其凋亡。WB结果显示,过表达CCN3能够显著促进PCNA、Cyclin E、Bcl-2、Vimentin、Snail和Twist蛋白表达,抑制Cyclin B1以及Bax蛋白表达;q RT-PCR实验提示,过表达CCN3能够抑制BMP2、4、6、7、9 mRNA水平,而干扰CCN3组可以明显促进BMP9 mRNA表达。结论:CCN3正向调控细胞增殖和迁移,同时抑制细胞凋亡;CCN3是BMP9的强效抑制因子。第二部分:目的:从CCN3浓度、MSCs分化程度、MSCs细胞密度3方面探讨CCN3调控细胞增殖的可能机制。方法:ELISA检测CCN3蛋白分泌水平,CCK-8实验检测不同浓度CCN3对MEFs增殖的影响;选择不同分化程度的两株MSCs细胞株作为研究对象,CCK-8检测CCN3对其增殖的作用;控制MEFs细胞密度,CCK-8实验了解CCN3对低、中、高密度的MEFs的影响。结果:ELISA结果显示:MEFs细胞为低密度时（30%）CCN3浓度在为0.27 ng/ml左右,中等密度（60%）CCN3浓度约为0.97-1.05 ng/ml左右,高密度（90%）CCN3浓度约为16.04-27.71 ng/ml左右,Ad-CCN3组CCN3浓度增加至849.62-1629.48ng/ml之间,而siCCN3组CCN3的浓度在9.09-22.5ng/ml之间;CCK-8结果表明,低浓度CCN3促增殖作用更好,CCN3对中间密度细胞增殖的促进作用更强;结论:CCN3调控MSCs增殖主要与MSCs密度有关。第三部分:目的:探究CCN3通过Notch调控MSCs增殖的机制。方法:采用Ad-CCN3和Ad-siCCN3上调和下调CCN3,Ad-dn Notch1下调Notch1,MAPK抑制剂下调MAPK。CCK-8检测细胞增殖,q PCR检测Notch下游基因表达,WB检测H3K9以及MAPK通路蛋白水平;结果:CCN3能够促进Notch1 mRNA水平,抑制DLL1 mRNA水平,干扰CCN3表达结果相反;DAPT和Ad-dn Notch1感染细胞后能够抑制CCN3的促增殖影响,过表达CCN3抑制Notch下游经典靶基因Rbpj、Hey1、p300、p53和p21 mRNA表达以及H3K9蛋白表达;PD98059作用后显著影响CCN3对MEFs的促增殖作用,且过表达CCN3促进ERK1+2、p-ERK1+2、JNK、p-JNK以及p38的蛋白表达,但抑制p-p38的蛋白表达。结论:CCN3促进MEFs增殖和迁移,抑制细胞凋亡的作用主要是通过抑制经典Notch信号及激活MAPK信号通路来发挥的。第四部分:目的:利用数据库分析CCN3对肿瘤发生发展的影响。方法:利用TCGA数据库、GEO数据库、Oncomine数据库、基因表达谱交互分析网站GEPIA2以及肿瘤免疫评估资源网站TIMER分析CCN3在肿瘤中的表达水平,以及CCN3与乳腺癌发展、转移和预后的关系。结果:多个数据库数据分析结果显示:与癌旁正常组织相比,乳腺癌中CCN3表达水平降低,其中以luminal B型降低最为显著。生存分析结果显示,高CCN3表达与乳腺癌较差的生存率相关,且主要与三阴性乳腺癌和管腔型乳腺癌患者的发展相关,其中高CCN3表达与生存率增加相关,CCN3表达水平与乳腺癌患者的年龄、发展阶段、肿瘤大小呈负相关,与淋巴结转移情况呈正相关。最后采用GEO数据库分析发现乳腺癌患者远处转移尤其是骨转移与CCN3-Notch1密切相关,可能通过影响POSTN等蛋白表达发挥调控作用。结论:生信结果不支持CCN3为促癌基因。