目的:胰岛素作为体内最主要降低血糖的激素,对机体葡萄糖的代谢至关重要。胰岛素的生物合成过程起始于在粗面内质网的核糖体上翻译为胰岛素的前体-前胰岛素原。前胰岛素原转位进入内质网后,形成胰岛素的另一个前体-胰岛素原。胰岛素原在内质网中正确折叠后,输出内质网进入高尔基体。在高尔基体中被酶解为胰岛素和C肽。成熟的胰岛素和C肽储存在分泌颗粒中,在葡萄糖刺激下,分泌到细胞外发挥生物学作用。胰岛素作为分泌蛋白,其分泌通路的顺畅对形成足够量有活性的胰岛素是基本保证。胰岛素原转运出内质网的前提条件是胰岛素原必须折叠形成其天然结构,然后被COP-Ⅱ囊泡转运到高尔基体中。研究证实,胰岛素基因突变诱导的青少年糖尿病造成血糖升高是由于胰岛素原在折叠过程中三个二硫键不能正确形成,导致胰岛素原不能形成可以输出内质网的天然状态。有研究报道,野生型胰岛素原在内质网折叠过程中也会形成10%-20%错误折叠的胰岛素原,但当减少野生型胰岛素原输出内质网后,野生型胰岛素原在内质网中的状态变化还不是很清楚,因此本研究拟探讨减少胰岛素原转运出内质网,对胰岛素合成量及胰岛素原状态的影响及对β细胞内质网应激的影响。方法:本研究通过两种不同方式减少野生型胰岛素原转运出内质网。一种是破坏胰岛素原转运出内质网的载体COP-Ⅱ的组装;第二种方法是我们发现氯喹-抗疟疾药物会减少胰岛素原转运出内质网。应用组成COP-Ⅱ囊泡的sar1A蛋白的突变腺病毒sar-1A H79G和sar-1A T39N及对照腺病毒sar-1A WT和GFP感染胰岛β细胞系MIN6细胞或者人胰岛细胞,利用免疫印迹及免疫荧光方法探讨sar-1A突变蛋白对细胞内蛋白产生显性负效应后,造成COP-Ⅱ囊泡不能有效的组装后,胰岛素原的分布,状态,胰岛β细胞的内质网稳态情况;利用免疫共沉淀方法探讨胰岛素原在内质网中折叠需要什么蛋白的协助。除了应用突变蛋白损伤COP-Ⅱ囊泡的组装,本研究中还应用了siRNA敲降sar-1蛋白的表达,检测胰岛素原的分布,在内质网中的状态。应用氯喹处理胰岛β细胞系MIN6细胞或者INS-1832/13细胞后,利用标记追踪技术或者免疫标记技术观察胰岛素的生物合成量;利用还原条件及非还原条件免疫印迹方法检测胰岛素原的状态;利用细胞免疫荧光方法检测胰岛素原的分布;利用免疫印迹及免疫荧光方法检测氯喹对其他蛋白分泌的影响。结果:COP-Ⅱ囊泡组装损伤后,胰岛素原转变为胰岛素的量减少,应用放线酮追踪胰岛素原2小时后,突变组细胞中胰岛素原量明显高于对照组。过表达sar-1A突变蛋白的MIN6细胞或者人胰岛中错误折叠的胰岛素原明显增多,并且内质网应激指标p-e-if-2α和CHOP蛋白的表达量升高。但应用siRNA敲降INS-1/2基因后,细胞中胰岛素的合成量减少,错误折叠的胰岛素原也减少。同时观察到上述两个内质网应激指标下降。在应用siRNA敲降sar-1A/B蛋白组,额观察到了胰岛素原错误折叠。BIP和PDI都会与胰岛素原相互作用,错误折叠胰岛素原增多时,与胰岛素原相互作用的BIP也会相应增加。氯喹会将胰岛素原阻滞在内质网中,减少胰岛素的合成量。氯喹造成胰岛素原错误折叠,但没有损伤胰岛素原出内质网的载体COP-Ⅱ。氯喹不会影响羧基肽酶在细胞内的转运。氯喹会引起胰岛β细胞内质网应激指标p-e-IF-2α和CHOP表达量升高,减少错误折叠的胰岛素原后,升高的内质网应激指标下降。结论:1.该研究提示错误折叠的胰岛素原是内质网前向输出异常造成胰岛β细胞内质网应激的主要诱因。2.该研究揭示了有效内质网(ER)输出在维持ER稳态,胰岛素原的天然折叠及胰岛素生物合成过程中的病理生理学意义。鉴于胰岛素原错误折叠在突变胰岛素基因诱导的青年糖尿病(MIDY)和2型糖尿病中起重要作用,靶向增强胰岛素原ER输出可能是预防或延迟胰岛素原错误折叠和ER应激引起的β细胞衰竭的潜在治疗靶点。