磷酸化修饰甘露寡糖结构表征及对大鼠肠道健康的影响

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甘露寡糖(MOS)在提高动物生长性能、增强机体免疫力、调控肠道微生态平衡、改善动物肠道形态等方面具有显著作用,目前广泛应用于畜牧业的养殖生产。磷酸化修饰的多糖或寡糖,由于结构的改变而影响其生物活性。本研究拟以甘露寡糖为原料,利用混合磷酸盐法进行磷酸化修饰制备磷酸化甘露寡糖(PMOS),对其进行结构表征,并探究其生物活性。1.磷酸化甘露寡糖的制备及物性结构分析在超声波辅助下,以甘露寡糖为原料,经混合磷酸盐法(甘露寡糖与多聚磷酸钠和三偏磷酸钠质量比为3:10:2),在p H9、80℃条件下反应5 h,制备磷酸化甘露寡糖。制备的磷酸化甘露寡糖中磷的含量为6.67%,取代度为0.44。经磷酸化修饰后的甘露寡糖无定型块状颗粒增加,颗粒表面平滑;傅里叶红外吸收光谱分析发现增加了1105cm-1处的P=O伸缩振动峰和913 cm-1处的P-O-C弯曲振动峰。磷酸化修饰可降低甘露寡糖的X射线衍射峰值,使主峰呈弥散状,结晶程度降低,无定型结构增多。甘露寡糖的磷酸化修饰过程伴随着质子转移,使其核磁氢谱产生新的谱峰。2.磷酸化甘露寡糖的体外生物活性研究对制备的磷酸化甘露寡糖分别进行体外自由基清除、细胞毒性和细胞的抗氧化能力研究,结果如下:(1)通过对DPPH、ABTS和羟基自由基的体外清除率及铁还原力的测定发现,随着磷酸化甘露寡糖浓度的增加其清除自由基的能力增强,5 mg/m L的磷酸化甘露寡糖对DPPH、ABTS和羟基自由基的体外清除率分别为46.75%、45.17%和99.8%,显著高于相同质量浓度下甘露寡糖的清除率(P<0.05)。铁还原能力试验表明磷酸化甘露寡糖铁还原力呈剂量依赖效应,显著高于甘露寡糖的铁还原力。1 mg/m L的磷酸化甘露寡糖铁还原力高于甘露寡糖20.53%(P<0.05),在5 mg/m L时,提高了34.73%(P>0.05)。(2)通过MTT法测磷酸化甘露寡糖对IPEC-1细胞毒性试验研究发现,PMOS在800和1000μg/m L浓度时会抑制IPEC-1的生长,而低于400μg/m L浓度则无显著抑制增殖作用(P<0.05)。(3)采用100、200、400μg/m L PMOS对IPEC-1细胞预处理24 h,然后再用0.4μmol/m L H2O2处理4 h,探究PMOS对IPEC-1细胞的氧化损伤的抑制作用。结果表明,与H2O2氧化损伤对照组相比,400μg/m L的PMOS预处理可以显著抑制H2O2对IPEC-1的氧化损伤(P<0.05),提高细胞内CAT和T-AOC的活性(P<0.05),同时降低细胞内MDA和细胞上清培养液的LDH水平。3.磷酸化甘露寡糖对大鼠肠道损伤抑制机制的研究试验采用单因素试验设计,将6周龄SD雄性大鼠36只,随机分为6个处理组,即对照组(0.9%的生理盐水)、负对照组(ASA损伤组,灌服200 mg/kg ASA),不同浓度PMOS预处理组(100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg,三组同时灌服200 mg/kg ASA),正对照组(只灌服PMOS,200 mg/kg)。结果表明,大鼠灌服磷酸化甘露寡糖可以抑制ASA对大鼠的肠道的损伤。与ASA损伤组相比,400 mg/kg PMOS预处理的大鼠的体增重、肝脏指数和胸腺指数显著增加(P<0.05),同时抑制肠道坏死,提高肠道隐窝深度和绒毛高度以及绒毛高度和隐窝深度的比值(P<0.05),并降低血清中NFκB和MDA含量,提高T-AOC活性。此外,磷酸化甘露寡糖可以下调肠道组织内NFκB和IL-6基因的表达(P<0.05),提高Occludin基因和蛋白相对表达水平(P<0.05)。因此,本试验条件下,400 mg/kg PMOS可通过提高脏器指数、降低血清中炎症因子含量,并调控肠道组织NFκB和Occludin信号通路来提高其m RNA及蛋白表达,抑制ASA对大鼠生长性能和肠道的损伤。
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