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新城疫(Newcastle Disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)引起的引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,严重危害世界养禽业,已造成的经济损失巨大。NDV属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属,基因组是不分节段、单股负链RNA。目前己报道的大多数强毒分离株均属于Class Ⅱ,而Class Ⅰ中大部分是低致病力的弱毒株(loNDV)或无毒株,这些loNDV普遍存在于各种家禽和野鸟体内,但是由于Class Ⅰ毒株宿主具有高度迁徙的特点,极易导致NDV由野鸟或水禽向家禽中转移,进而演化为临床致病性强毒。本室研究员于圣青实验证实,野生健康水禽的携带非致病性NDV毒株,经9次SPF鸡体内气囊传代(9a)和5次脑内传代(5b)后,能够逐渐突变为速发型NDV,命名为9a5b。本室已对亲本病毒和各代次突变株进行了进行全基因组测序,并初步研究了它的一些生物学特性。为了从分子水平上进一步研究Class Ⅰ NDV的遗传进化机制,本研究构建了含有此毒株的NP、P与L基因的的三个真核表达质粒,利用微型基因组对三个表达质粒的功能进行了鉴定；根据全基因组序列设计引物分段克隆,构建此病毒的全基因组cDNA克隆；将全基因组cDNA克隆和三个辅助质粒按照不同的比例分别共转染BSR-T7/5细胞,摸索Class Ⅰ NDV拯救的条件,目前Class Ⅰ NDV仍没有成功拯救的报道,此研究旨在试图建立Class Ⅰ NDV的反向遗传技术平台,以便于利用此平台进行Class Ⅰ NDV的功能基因组研究和探索新型疫苗的研发。1. Class Ⅰ新城疫病毒9a5b株NP、P和L辅助质粒的构建及功能鉴定根据Genbank已发表的9a5b株的全基因组序列,设计了5对引物,经RT-PCR从9a5b株NDV尿囊液中扩增目的片段,分别克隆入pGEMT-easy载体中。将引物NP、P的扩增片段连入pGEMT-easy载体,利用两端设计的酶切位点连入同样限制酶酶切的真核表达载体pCI-neo中,得到表达质粒pCI-NP、pCI-P,并测序鉴定。将引物L1、L2、L3扩增的片段连入pGEMT-easy载体,利用两端设计的酶切位点分别连入同样限制酶酶切的真核表达载体pCI-neo中,得到表达质粒pCI-L,并测序鉴定。将本室于洋构建的9a5b株微型基因组(Mini-genome) TVT-LGT和以上构建的三个重组表达质粒共转染BSR-T7/5细胞,发现在倒置显微镜下能看到明显的特异性绿色荧光,说明构建的三个辅助质粒能够正确表达相应蛋白,形成核糖核蛋白复合物(RNPs),完成基因组的复制和病毒基因的转录。2. Class I新城疫病毒9a5b株全基因组cDNA的转录质粒的构建根据已上传Genbank的9a5b株全基因组序列,本研究将全长cDNA分为A1、A2、A3、B1、B2、B3 6段分别进行克隆。设计6对引物,RT-PCR扩增6个片段,分别连入pGEM T easy载体。T-B3和T-B2用Sal Ⅰ和BssH Ⅱ酶切后进行体外连接得到质粒T-B283。用Sac Ⅱ酶切T-B283和T-B1,酶切产物去磷酸化处理后连接获得质粒T-B1B2B3.取T-B1B2B3和TVT-3’5’阳性质粒用SpeⅠ酶切,酶切产物去磷酸化处理后连接为TVT-B。T-A1和T-A2用Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后连接为T-A1-A2。T-A1-A2用EagⅠ酶切,TVT-3’5’经EagⅠ酶切并用CIAP进行去磷酸化后连接为TVT-A1-A2。 PCR2.1T-A3经StuⅠ和SacⅠ酶切和TVT-3’5’连接为A3-TVT。TVT-A1-A2和A3-TVT用SacⅠ和MluⅠ酶切后连接为TVT-A。TVT-B和TVT-A用SalⅠ和AgeⅠ酶切后连接为全长质粒TVT-BA。酶切鉴定阳性的质粒经测序鉴定连接正确,没有出现突变、缺失或非模板序列插入。3. Class Ⅰ新城疫病毒9a5b株的拯救条件的探索将NDV9a5b株全基因组cDNA克隆和含9a5b株NP、P、L基因的辅助质粒按不同比例共转染BSR-T7/5细胞,转染后48h,60h,72h收获转染细胞及其上清接种SPF鸡胚。将不同的转染样品接种后死亡鸡胚尿囊液,HA效价检测为28。三次鸡胚传代后,尿囊液的HA效价均为28,全基因组测序也正确。这说明病毒能够成功拯救。重复拯救实验,病毒依然能够拯救成功。全文小结：(1)应用RT-PCR方法扩增获得了9a5b株NDV NP、P、L基因,分别构建了3种病毒复制必须的的真核表达质粒。(2)利用9a5b株的微型基因组对所构建的三个表达质粒进行了功能检测,证明能够正常启动病毒的复制和转录。(3)根据全基因序列设计引物分段克隆,利用适合的酶切位点进行连接,获得9a5b株全基因组cDNA转录质粒。(4)初步探索9a5b株的反向遗传拯救的体系,将不同的转染产物接种鸡胚,接种的鸡胚大约在40h左右死亡,尿囊液HA效价为28,三次鸡胚传代后,尿囊液HA效价均为28,说明病毒可以成功拯救。将病毒拯救实验重复,依然能够成功拯救出病毒。