论文部分内容阅读
红曲霉(Monascus spp．)是我国传统的食用和药用微生物，在我国已有上千年的应用历史。它能分泌产生色素、莫呐可啉类(monacolins)物质、γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid，GABA)、麦角固醇和丰富的水解酶类等多种有益代谢产物，是生产食品发酵剂、着色剂、保健食品、药品或其原料的重要微生物资源。目前，国内外对红曲霉菌种的分类、选育、代谢产物分离纯化及发酵条件的研究较多，而有关红曲霉的分子生物学研究才刚刚起步。GenBank检索结果查见，与红曲霉相关的核酸序列大部分是研究分类和亲缘关系的，有关功能基因的研究很少，而关于红曲霉产色素基因的研究尚未见报道。近年来，利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导T-DNA转化真菌获得突变体的方法成为寻找和鉴定新基因的有效手段。本课题采用根癌农杆菌介导的T-DNA转化法建立了包含5100多株转化子的红曲霉转化子库，从转化子库中筛选得到了24株菌落颜色发生了明显变化的色素突变子，并对其菌落形态及显微结构、潮霉素抗性稳定性及主要代谢产物的分泌能力等进行了分析。在此基础上，采用TAIL-PCR分离到8株色素突变子T-DNA插入位点的左侧序列，并应用RACE技术克隆得到了一株色素突变子805~#T-DNA插入位点的cDNA全长序列，采用基因敲除(gene knock-out)技术对其功能进行了验证。具体研究结果如下：1转化子库的构建及色素突变株的筛选通过优化农杆菌(A．tumefaciens)介导的T-DNA转化红曲霉的条件，构建了包含5100多个转化子的转化子库。T-DNA的PCR验证结果表明，随机挑选的60株转化子均含有T-DNA插入片段。24株随机挑选的转化子的Southern杂交结果表明，T-DNA单拷贝插入率为70.8％。通过对转化子菌落形态的观察，筛选得到53株形态发生明显变化的转化子，其中24株为菌落颜色发生显著变化的色素突变子，其编号分别为189~#、192~#、533~#、635~#、733~#、805~#、959~#、1132~#、1164~#、1263~#、1295~#、2066~#、2606~#、2887~#、3108~#、3257~#、3715~#、3742~#、4081~#、4096~#、4591~#、4698~#、4963~#和4968~#。色素突变子连续传代培养5代后，除733~#、1132~#、3715~#和4591~#外，其它20株色素突变子均能在潮霉素抗性培养基上稳定生长，潮霉素抗性稳定性达83.3％。2色素突变子产红曲色素、monacolin K、GABA和桔霉素的分析采用UV-VIS、TLC、HPLC等方法对上述20株潮霉素抗性稳定的色素突变子的固态发酵产物红曲的色素(包括色价、吸收波长、色素组分)、monacolin K、GABA和桔霉素的产生情况进行了分析。结果表明，与出发菌株相比，色素突变子产代谢产物的能力都发生了不同程度的变化。在产色素方面，色素突变子959~#的色价最高，达2 712，是出发菌株M-7色价1228的2.2倍；1263~#的色价最低，仅为20，只有出发菌株M-7色价的0.01倍。另外，色素突变子红曲乙醇萃取液的UV-VIS扫描图谱和色素组分也发生了显著的变化。在产monacolin K方面，突变子4081~#红曲的含量最高，达1601μg／g，而出发菌株M-7红曲的含量低于0.1μg／g。在产GABA方面，突变子1263~#红曲含量最高，达6183.9μg／g，是出发菌株M-7 436.3μg／g的14.2倍；635~#红曲的含量最低，只有156.1μg／g，约为出发菌株M-7的0.33倍。在产桔霉素方面，突变子635~#红曲的含量最高，达154.57μg／g，是出发菌株0.75μg／g的206倍；1295~#含量最低，为0.10gg／g，为出发菌株的0.1倍。比较上述20株色素突变子产色素和桔霉素的情况，可将其分为4类：第一类，色价和桔霉素都升高的，包括635~#、959~#、1164~#、2066~#、2606~#、2887~#、4081~#和4698~#共8株；第二类，色价和桔霉素都降低的，包括805~#、1295~#、3742~#和4968~#共4株；第三类，色价降低而桔霉素含量升高的，包括189~#、192~#、1263~#和4963~#共4株；第四类，色价升高而桔霉素降低的，包括533~#、3108~#、3257~#和4096~#共4株。从上述四类突变子中挑选出635~#、1164~#、2606~#、805~#、1295~#、189~#、1263~#、4963~#、533~#和3257~#共10株代表性菌株，作为研究红曲霉产色素相关基因的材料。3色素突变子T-DNA插入位点侧翼序列TAIL-PCR扩增及扩增片段功能分析采用TAIL-PCR法对上述10株色素突变子T-DNA插入位点的侧翼序列进行了扩增，得到了635~#、1164~#、2606~#、805~#、3257~#、189~#、4963~#和533~#共8株突变子T-DNA插入位点左侧的DNA序列，扩增的DNA片段长度介于500 bp～1 300 bp之间。FASTA比对分析表明，805~#突变子DNA扩增序列与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Af293的G蛋白信号调节子(regulator for G-protein signaling，RGS)功能域的同源性达84％：其它7株突变子的T-DNA插入位点侧翼的DNA序列未发现有功能明确的相似性序列。突变子533~#、1164~#和2606~#的DNA扩增片段已经登陆Genbank，登陆号分别为DQ861336、DQ861338和DQ1337。4红曲霉G蛋白信号调节子的功能验证以突变子805~#扩增序列的Blast比对分析结果为依据，设计特异性引物，采用RACE技术，扩增得到了对应于该DNA序列的2012 bp的cDNA序列。ORFfin工具分析显示，其包含的最长开放读码框架(open reading frame，ORF)为1851bp，推衍得到包括了RGS和2个DEP(disheveled，Eg1+10，pleckstrin)3个结构域在内的氨基酸序列。以RGS结构域两侧的DNA序列为同源臂，采用基因敲除(gene knock-out)技术对其功能进行了初步研究。研究结果表明，805~#突变子T-DNA插入位点的基因，即编码红曲霉FlbA(nuffy for brlA)的序列对红曲霉色素分泌具有正调节作用。