背景:　　 肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属，是引起手足口病的主要病原体。EV71于1969年首次分离得到，已在世界范围内引起多次爆发和流行。感染EV71后可引起多种疾病，如手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹、脑炎等多种神经系统并发症。HFMD的广泛流行已经成为重大的公共卫生问题，因此研制安全有效的疫苗成为控制HFMD流行的首要措施,目前已有多种措施来提高DNA疫苗的免疫效果，如能有效改善DNA疫苗免疫应答的佐剂，包括各种细胞因子、黏附因子、蛋白因子、化学分子、脂质体等。以前的研究发现GITRL能够诱导特异性免疫应答，因此我们考虑将GITRL作为免疫佐剂来构建一种新的DNA疫苗。　　 方法:　　 (1)采用PCR的方法扩增EV71外壳蛋白VP1和mGITRL基因，连接至PMD-18T载体，选择阳性克隆进行序列测定。编码mGITRL蛋白的重组质粒pIRES/mGITRL为本实验室所有，将VP1基因入到pIRES载体多克隆位点A(multiplecloningsiteA)中构建pIRES/VP1/mGITRL和pIRES/VP1。将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中，进行PCR、酶切鉴定和序列测定。　　 (2)体内实验中，将雌性Balb/c小鼠随机分成5组，每组6只，分别是PBS组，plRES组，pIRES/VP1组，pIRES/mGITRL组，pIRES/VP1/mGITRL组。在接种质粒前，先在股四头肌注射0.25％的布比卡因进行预处理，连续注射3天，第四天在同一部位注射质粒DNA100μg，接种剂量为100μl，每两周加强免疫一次，共加强免疫三次。第三次免疫后第七天，采用ELISA检测血清中的特异性抗体水平。　　 (3)第三次免疫后第7天处死小鼠，制备小鼠脾细胞悬液，以1.0×106/孔的浓度加入24孔板中，于培养结束前5h加入PMA(50ng/ml)、离子霉素(1μg/ml)和莫能霉素(2μg/ml)，加入抗CD3单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体进行表面标志的荧光染色，加入IL-4单克隆抗体、IFN-γ单克隆抗体进行胞内细胞因子的荧光染色，通过FCM进行检测。　　 结果:　　 (1)成功构建pIRES/VP1，pIRES/mGITRL，pIRES/VP1/mGITRL三个重组质粒，通过酶切鉴定和序列测定，能得到预期的891bp的VP1基因片段和522bp的mGITRL基因片段。　　 (2)为了验证mGITRL是否能够诱导特异性体液免疫应答，在第三次免疫后第7天处死小鼠，用ELISA检测血清中特异性抗体水平。实验结果显示，与对照组相比，pIRES/VP1组和pIRES/VP1/mGITRL组均产生了不同程度的特异性抗体。并且，pIRES/VP1/mGITRL组产生的抗体水平高于pIRES/VP1组。　　 (3)为了验证T细胞胞内细胞因子的表达，第三次免疫后第7天处死小鼠后收集脾脏细胞，以1.0×106/孔的浓度加入24孔板中，于培养结束前5h加入PMA(50ng/ml)、离子霉素（1μg/ml）和莫能霉素（2μg/ml），加入不同的荧光标记抗体，通过FCM进行检测CD4+IFN-γ+T细胞比例，CD8+IFN-γ+T细胞及CD4+IL-4+T细胞比例。实验结果显示pIRES/VP1/mGITRL组CD4+IFN-γ+T细胞比例，CD8+IFN-γ+T细胞及CD4+IL-4+T细胞比例显著高于其余四组，说明mGITRL作为基因佐剂可以诱导特异性的细胞免疫应答。　　 结论:　　 通过我们的研究发现mGITRL作为基因佐剂可以诱导抗原特异性的体液免疫和细胞免疫应答，EV71DNA疫苗联合佐剂mGITRL的使用可能成为具有发展潜力的疫苗策略。