刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）因其果实中含有丰富的维生素C（L-Ascorbic acid,As A）等对人体有重要医药保健作用的营养与活性物质而广受关注。近年来对于刺梨这一特色果树重要经济性状的分子生物学和基因工程研究逐渐深入,越来越多的功能基因被挖掘鉴定,但由于能用于刺梨遗传转化的高效再生体系至今尚未建立,使得这些基因的功能验证还无法实现。病毒诱导基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）技术是通过在病毒基因组中插入一段目标基因片段,侵染植物组织之后与插入片段同源的内源目的基因的表达受到抑制并表现出相应的性状缺失,以快速验证目标基因功能。因此,刺梨VIGS技术体系的建立对于阐释和验证关键生物学过程中关键基因的功能具有迫切需求。本研究以刺梨八氢番茄红素脱氢酶基因（phytoene desaturase,Rr PDS）为报告基因,在刺梨上建立基于烟草碎裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）的VIGS体系,优化侵染方案,以为快速、高效开展刺梨基因功能研究建立新的技术平台。在此基础上,通过VIGS技术沉默刺梨As A合成关键基因GDP-L-半乳糖磷酸酶（GDP-L-galactose pyrophosphatase,Rr GGP）的表达,以进一步验证其在刺梨果实As A合成过程中的作用。主要研究结果如下:1.基于TRV的刺梨VIGS病毒载体的构建。根据基因组的数据筛选查找出Rr PDS及Rr GGP基因序列并设计引物,通过RT-PCR分别扩增两个基因靠近5’端的321 bp Rr PDS序列和385 bp的Rr GGP序列作为目标片段,分别将这两段目的片段与TRV病毒载体连接,得到重组载体TRV2-Rr PDS和TRV2-Rr GGP,用于基因沉默。2.刺梨幼苗的VIGS体系的建立。将构建的重组载体TRV2-Rr PDS转入农杆菌GV3101,菌液浓度OD600调整为1.0,以刚刚长出真叶的刺梨实生幼苗为材料,接种后48d刺梨叶片呈现光漂白现象;该体系在扦插枝条的叶片上也能运用,但光漂白现象没有接种于刺梨幼苗叶片表现的明显。3.刺梨幼苗VIGS体系的优化。比较了接种方法、侵染液浓度、培养温度对刺梨幼苗PDS基因沉默的影响。结果表明:刺梨幼苗VIGS体系的适合的接种方法为注射渗透法,菌液浓度OD600值为1或1.5,接种后植物的适合培养温度为25℃,在此方案下沉默效率可达约65%。4.刺梨果实Rr GGP基因的沉默。将构建好的刺梨TRV2-Rr GGP载体转入农杆菌GV3101,通过注射法侵染刺梨果实,侵染培养20天后,采用q RT-PCR及HPLC法对沉默果实中Rr GGP的表达量及As A含量进行测定。结果表明,侵染刺梨果实内源Rr GGP基因的表达量较对照降低了42.4%,从而导致沉默果实中维生素C含量降低了30.1%,再次验证了Rr GGP基因为刺梨果实As A合成途径的关键基因。采用q RT-PCR测定Rr GGP沉默后对刺梨As A合成途径及再生途径的相关基因的表达量,结果表明,该基因沉默后,其合成途径及再生途径的基因会受到不同程度的抑制。