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能源短缺和环境恶化已成为经济发展、生产力进步的重大阻碍。氢气是一种储能高、清洁、可再生的绿色能源,可作为传统化石能源的替代品。氢气生产方式中暗发酵产氢因其原料来源广泛、成本低廉、操作简单等优点受到广泛关注。Fe、Ni作为氢酶活性中心重要的激活元素,近年来多制备成不同类型纳米颗粒添加至暗发酵产氢体系,这些金属纳米颗粒除可作为氢酶活性中心结合元素,且其表面效应和量子尺寸效应对生物氢的合成均可起到一定促进作用,因此金属纳米颗粒添加对暗发酵产氢过程的调控已成为生物制氢领域引人瞩目的研究课题。本研究以水葫芦提取液为原料,与Fe、Ni金属离子反应,制备相应的金属氧化物纳米颗粒,并将其添加至Klebsiella sp.发酵木质纤维素水解糖液产氢体系,考察其对产氢过程的调控作用。通过对发酵过程中生物氢产量、菌体生长量、水解糖基质消耗进行监测,研究Fe、Ni氧化物纳米颗粒对Klebsiella sp.暗发酵产氢的调控作用,并通过荧光定量PCR分析阐释这些纳米颗粒调控菌株暗发酵产氢的作用机理。具体研究内容如下:(1)以水葫芦提取液为原料,与一定浓度Fe、Ni离子反应,制备了 Fe、Ni氧化物纳米颗粒。经XRD、TEM、SEM分析,两种工序制备的氧化镍纳米颗粒形貌相同,但聚集状态和粒径分布不同,其中N6NPs的平均粒径为9.3nm,N8NPs的平均粒径为9.5 nm;而纳米氧化铁经XRD表征分析为磁铁矿,进一步通过TEM、SEM检测,确定该纳米颗粒为球形、聚集成团的磁性Fe3O4NPs,且平均粒径为13.0 nm。(2)首先研究了不同浓度Fe2+对Klebsiella sp.发酵产氢特性的影响,结果表明添加Fe2+浓度为10-20 mg/L可促进克雷伯氏菌发酵棉秆水解糖液合成生物氢,尤以Fe2+添加浓度为20 mg/L的累积产氢量最高,达2200 mL/L以上,较未添加Fe2+处理的提高约20%,由此证实Fe元素的添加可能改善氢酶活性从而调控生物氢的合成。进一步研究了不同粒径Fe3O4NPs对Klebsiella sp.发酵产氢特性的影响,结果显示,当添加粒径为10 nm时累积产氢量最高,其添加浓度为30 mg/L时可达到5300 mL/L以上,较未添加纳米颗粒的处理提高约61.8%,且该处理Fe3O4NPs的添加除可有效促进菌株合成生物氢,还有利于还原糖的利用和菌体的生长。此外,还深入研究了添加不同浓度的绿色合成Fe、Ni氧化物纳米颗粒对Klebsiella sp.发酵产氢的调控作用,研究结果表明两种工序制备的NiONPs在不同添加浓度对菌株发酵产氢的调控作用不同,N6NPs的添加浓度为5-30 mg/L时,对发酵产氢有促进作用,尤以添加浓度为20 mg/L时的累积产氢量最高,达4742 mL/L,较对照处理(0 mg/L)的提高约44.2%。添加N8NPs的处理中,仅添加浓度为20 mg/L处理具有显著提高产氢的调控作用,其累积产氢量最高,达4100 mL/L,较之对照处理的提高约24.8%,浓度过高或过低均抑制菌株发酵产氢;绿色合成的Fe3O4NPs在较低添加浓度范围内(10-20mg/L),菌株发酵120h的累积产氢量高于对照处理,尤以Fe3O4NPs添加浓度为20 mg/L的累积产氢量最高,达4 000mL/L以上,较对照组(0 mg/L)处理的提高约20%。(3)检测了不同纳米颗粒添加处理下Klebsiella sp.的氢酶活性,结果表明,不同纳米颗粒添加处理的氢酶活性均在发酵24 h达到峰值,尤以添加N6NPs处理的效果最显著,较之对照处理提高2倍。应用实时荧光定量PCR技术研究了在不同的绿色合成金属氧化物纳米颗粒添加下,氢酶基因表达量的变化。结果显示,在培养基中按最佳浓度添加上述绿色合成的三类金属氧化物纳米颗粒,Klebsiella sp.在发酵24h内氢酶基因的表达量显著提高,尤以添加20mg/LN8NPs处理的作用效果最显著,其基因表达量提高倍数达7.4。由此说明,这些绿色合成的金属氧化物纳米颗粒可能在发酵早期对氢酶起到激活作用从而促进菌株生物氢的合成。