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药物引起的Ⅰ型超敏反应是药物刺激机体产生的特异性IgE介导的过度免疫应答,其主要的临床表现有皮炎、荨麻疹、哮喘、血管神经性水肿、胃肠变态反应、过敏性休克等症状,严重时可导致迅速死亡,又称为速发型超敏反应(Immediate hypersensitivity reactions,IHRs)。新药的研发必须经过临床前安全性的评价,而药物诱导IHRs的潜能(药物过敏性预测)是新药临床前安全性评估的必需环节。由于缺乏理想的临床前实验模型,目前尚不能有效的准确预测药物的致敏性,特别是预测小分子药物(Low molecule weight compounds,LMWC)的致敏性更是一个世界性难题,迫切需要建立一个更加有效的LMWC致敏性评价模型。正常外周血中含量最少的白细胞通常是嗜碱性粒细胞,但却是除肥大细胞IHRs最重要的效应细胞。目前临床上,自体外嗜碱性粒细胞激活试验(Basophil activation test,BAT)被开发及研究以来,其已广泛应用于研究和确诊过敏疾病(包括食物、毒液、花粉和药物等引起的过敏)。它的基本原理是在体外模拟IHRs活化嗜碱性粒细胞后,利用流式细胞术检测细胞表面活化标记物的变化,进而诊断和研究过敏疾病。与其它诊断方法比较,BAT仅需要少量外周血样品,且系体外与致敏原孵育激发,具有安全性高、耗时短、特异灵敏、技术成熟、操作简单等优点。但BAT在动物身上研究较少,所以其在药物非临床评价中的研究和应用任有待开发研究。借鉴临床上BAT的方法,探讨建立致敏动物外周血BAT模型,有望形成一种能和临床前长期毒性试验相结合的药物致敏性评价新技术,改善我国预测LMWC致敏性评价的水平。BALB/c小鼠高表达IgE,已被广泛用于各种药物过敏反应的动物模型构建,是研究TH2型免疫反应的主要小鼠品系。同时考虑到,大鼠是药物临床前安全性评价中长期毒性试验研究最常用的动物,而BN大鼠同样也是免疫球蛋白(尤其是IgE)高应答品系,可作为研究IHRs的主要模型动物。本课题拟首先建立BALB/c小鼠和BN大鼠BAT模型,然后选择临床上常发生IHRs的青霉素G(Penicillin G,PG)为工具药,模拟LMWC体内致敏和激发形成IHRs的半抗原假说机制。把半抗原PG和大分子蛋白质载体体外藕联形成全抗原。然后以PG 和 BSA 的藕联物(Penicillin G conjugated BSA,PG/BSA)致敏 BALB/c 小鼠和BN大鼠。取致敏动物外周血,体外与PG和OVA的藕联物(Penicillin G conjugated Ovalbumin,PG/OVA)共孵育,流式细胞术观察嗜碱性粒细胞活化标记物CD63分子的表达情况,以期验证BAT模型预测LMWC致敏性的有效性。实验第一部分:首先建立基于流式细胞术(CD45 APClow/IgEFITChigh)鉴定BALB/c小鼠嗜碱性粒细胞的方法。同时,利用传统瑞氏-姬姆萨染色法染色小鼠血涂片,显微镜下观察小鼠嗜碱性粒细胞的形态,并计数其相对数量。比较对照组和卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏BALB/c小鼠嗜碱性粒细胞的形态及数量变化。比较流式细胞术与传统血涂片计数二者之间的差异和计算二者的相关性。选择以CD45 APClow/IgE FITChigh作为鉴定小鼠嗜碱性粒细胞的流式方案,研究anti-IgE(阳性对照)体外与小鼠嗜碱性粒细胞孵育后CD63的表达情况,确定小鼠嗜碱性粒细胞活化标记物,并优化体外孵育时间。OVA致敏BALB/c小鼠外周血,体外以OVA激发致敏的小鼠嗜碱性粒细胞后,流式细胞术检测嗜碱性粒细胞CD63表达情况,以建立小鼠BAT模型。同时,以传统的被动皮肤致敏试验(Passive cutaneous anaphylaxis,PCA)证实小鼠处于致敏状态。为了验证小鼠BAT预测LMWC致敏的准确性,选择临床上可导致IHRs的典型药物PG为工具药,首先以PG/BSA致敏BALB/c小鼠,然后取致敏小鼠外周血,体外与PG/OVA共孵育,以激发小鼠嗜碱性粒细胞,观察CD63分子的表达情况,验证小鼠BAT模型检测LMWC的有效性。结果显示:(1)流式细胞术计数显示,对照组和致敏组小鼠嗜碱性细胞的数量分别是0.59±0.14%和0.54±.018%,但二者未见明显差异(P>0.05)。小鼠血涂片形态观察显示,对照组与致敏组嗜碱性粒细胞形态未见明显改变;嗜碱性粒细胞数量分别为0.60±0.42%和0.70±0.27%,二者未见统计学差异(P>0.05)。两种计数方法t检验为无显著性差异(P>0.05),相关系数R=0.51,说明以CD45 APClow/IgEFITChigh可以作为鉴定小鼠嗜碱性粒细胞的标记物。(2)Anti-IgE体外可刺激小鼠嗜碱性粒细胞表面CD63的表达,体外最佳孵育时间为15 min,提示CD63可作为建立小鼠BAT模型的激活标记物。(3)OVA致敏小鼠的外周血体外与OVA孵育后,嗜碱性粒细胞表面CD63表达为59.70±37.93%,显著高于PBS体外刺激(2.15±1.13%P<0.05)。(4)PG/BSA致敏小鼠的外周血体外与PG/OVA孵育后,嗜碱性粒细胞表面CD63表达为62.74±41.05%显著高于PBS对照组(2.73±1.40%P<0.05)。表明成功建立了小鼠BAT并且此可以用于检测LMWC的致敏性。第二部分:首先建立流式细胞术(CD45 APClow/IgEFITChigh)鉴定BN大鼠嗜碱性粒细胞数量的方法,确定大鼠外周血中嗜碱性粒细胞群。同时利用瑞氏-姬姆萨法染色血涂片,显微镜下观察大鼠嗜碱性细胞的形态,并计数嗜碱性粒细胞的相对数量。比较对照组和OVA致敏的BN大鼠的嗜碱性粒细胞形态及数量变化。比较两种计数方法的相关性。由于大多数白细胞分化抗原在生物进化中具有保守性和在过敏性休克的大鼠模型中嗜碱性粒细胞表面CD63表达上升,所以建立BN大鼠BAT的体外孵育时间参考小鼠为15 min来检测CD63的表达情况。取肝素完全抗凝OVA致敏大鼠外周血,与OVA在37℃孵育15 min,流式细胞术检测嗜碱性粒细胞表面分子CD63的表达情况,PCA验证BAT中的大鼠是致敏状态。为了检测BAT预测LMWC药物致敏的准确性,以PG/BSA致敏大鼠PG/OVA体外激发,观察CD63分子的表达情况。(1)流式细胞术计数显示,对照组和致敏组大鼠嗜碱性细胞的数量分别是0.25±0.07%和0.24±0.10%,二者未见明显差异(P>0.05)。大鼠血涂片形态观察显示,对照组与致敏组比较未见明显形态改变;对照组与致敏组嗜碱性粒细胞数量分别为0.3±0.24%和0.4±0.37%,二者未见统计学差异(P>0.05)。两种计数方法t检验为无显著性差异(P>0.05),相关系数R=0.61,说明CD45APClow/IgEFITChigh可以作为鉴定大鼠嗜碱性粒细胞的流式方案。(2)OVA致敏大鼠的外周血体外与OVA孵育后,嗜碱性粒细胞表面CD63表达为35.00±23.90%,显著高于PBS体外刺激(1.78±1.08%P<0.05)。(3)PG/BSA致敏大鼠的外周血体外与PG/OVA孵育后,嗜碱性粒细胞表面CD63表达为31.10±20.04%显著高于PBS对照组(2.74±2.10%P<0.05)。BN大鼠建立的BAT可以用于检测LMWC的致敏性。综上所述:经致敏后的小鼠和大鼠嗜碱性粒细胞,当体外再次接触相同抗原时,流式细胞术可明显检测到嗜碱性粒细胞表面激活标记物CD63表达,表明小鼠和大鼠BAT模型构建成功。利用该模型可有效检测PG的致敏潜能,提示该模型可用于评价LMWC的致敏性。