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目的探索脓毒症造血干细胞、祖细胞、免疫细胞及其亚群的变化,并观察血必净注射液对脓毒症小鼠骨髓造血干细胞以及免疫功能的干预作用。方法通过集落形成实验和荧光定量PCR实验分析血必净注射液及其主要成分当归(3个不同产地)对体外小鼠骨髓细胞分化的影响。通过腹腔注射大肠杆菌脂多糖(LPS)建立脓毒症小鼠模型,并给予血必净注射液治疗:血必净组(n=20)按20mL/kg的剂量尾静脉注射血必净注射液,每日1次,连续4天;正常对照组(n=20)及模型组(n=20)均给予等量生理盐水,每日1次,连续4天。通过流式细胞术分析脓毒症小鼠骨髓造血干细胞、造血祖细胞、以及免疫细胞的变化,并分析血必净注射液对上述指标的影响,;通过荧光定量PCR分析血必净对脓毒症小鼠骨髓造血干细胞相关转录因子及信号通路mRNA表达的影响。临床收集脓毒症患者(n=8)及健康志愿者(n=5),采集外周血(脓毒症患者共采集3次:入组第1、4、7天;健康志愿者采集1次:入组第1天),并分离外周血单个核细胞(PBMC),通过流式细胞术分析脓毒症患者和健康志愿者外周血造血干细胞、造血祖细胞以及免疫细胞变化。结果(1)体外实验集落形成实验结果显示:与空白对照组相比,酒当归组和血必净组集落中细胞形态都发生明显改变,细胞表面突起增多。荧光定量PCR结果显示:在三个产地的酒当归组中,GATA2、Runx1、GFi1B、LSD1基因表达均有明显下调(均P<0.05);在血必净的所有三个浓度中,Runx1、GFi1B、FOS基因表达均有明显下调,CD5基因表达有明显上调(均P<0.05);当血必净浓度为1mg/ml和10mg/ml时,GATA2、LSD1、CD71、CD90和CD123基因表达均有明显下调(均P<0.05);当血必净浓度为0.1mg/ml和1mg/ml时,CD11b基因表达有明显下调(均P<0.05);当血必净浓度为10mg/ml时,CD133基因表达有明显上调(P<0.05)。(2)动物实验造模前,各组小鼠体质量差异无统计学意义(均P>0.05);造模后24h-48h,模型组及血必净组小鼠体质量明显减轻,造模后72h-96h,两组小鼠体质量逐渐增加,四个时间点体质量与正常对照组比较均有降低(均P<0.01),同时,在造模后24h,血必净组小鼠体质量明显高于模型组小鼠(P<0.05)。流式检测结果显示:与正常对照组相比,模型组骨髓和脾脏中髓源抑制性细胞(MDSC)比例明显增高,T细胞和B细胞比例明显下降(均P<0.05),应用血必净后均无明显变化,差异无统计学意义(均P>0.05)。模型组骨髓造血干细胞(LSK)比例较正常组明显升高,应用血必净注射液后造血干细胞比例明显下降(均P<0.01);进一步分析其亚群,结果显示:与正常对照组相比,模型组和血必净组的长期造血干细胞(LT-HSC)比例明显增多,而多能造血祖细胞(MPP)比例明显减少,血必净组MPP下降较模型组更为明显(均P<0.01)。模型组造血祖细胞(LS-K)比例较正常组明显升高(P<0.01),应用血必净注射液后造血祖细胞比例变化无统计学意义(P>0.05);模型组红系-巨核系祖细胞(MEP)比例较正常组明显升高(P<0.05),应用血必净注射液后比例明显下降(P<0.01)。荧光定量PCR结果显示:与正常对照组相比,模型组中GATA2、GFi1B、Runx1、FOS和LSD1基因表达均有明显下调,PU.1基因表达上调(均P<0.01),应用血必净注射液后FOS明显下调,LSD1明显上调(均P<0.05)。(3)临床研究一般资料和基本生命体征:健康对照组与病例组年龄差异无统计学意义(P>0.05),病例组体温及收缩压明显高于对照组(均P<0.05)。血常规检测显示:健康对照组数值均正常,病例组入组第1天(D1)、入组第4天(D4)白细胞计数、中性粒细胞百分比和中性粒细胞计数均高于对照组(均P<0.05),且病例组入组第7天(D7)中性粒细胞百分比相较D1明显下降(P<0.05);病例组D1、D4淋巴细胞百分比和淋巴细胞计数均低于对照组(均P<0.05),且病例组D7淋巴细胞百分比相较于D1明显上升(P<0.05)。外周血流式检测结果显示:病例组D1、D4的T细胞和CD4+T细胞比例明显低于对照组(均P<0.01),且在病例组D7时T细胞和CD4+T细胞比例相较于D1有明显上升(均P<0.05);病例组D1、D4、D7的CD8+T细胞比例明显低于对照组(均P<0.05),且相比于病例组D1、D4,病例组D7时CD8+T细胞比例明显增加(均P<0.05);同时,与健康对照组相比,病例组D4时CD34+细胞、造血祖细胞(CD34+CD38+)和髓系祖细胞(CMP)比例都有明显增加(均P<0.05)。结论1.血必净注射液可通过影响体外小鼠骨髓细胞转录因子的表达,促进骨髓细胞的分化。2.脓毒症小鼠造血干细胞异常增殖,免疫功能下降,血必净注射液可通过改善脓毒症小鼠骨髓造血干细胞的分化障碍,减少异常增殖,其机制可能与LSD1等基因的表达上调有关。3.脓毒症患者外周血造血祖细胞异常增殖,而免疫细胞(T细胞)数量下降。