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溃疡性结肠炎是一种病因不明的慢性复发性现代难治病。随着我国国民生活水平的提高,溃疡性结肠炎的发病率逐年提高,已经严重威胁到人们的健康生活。但是由于以免疫抑制和抗炎为主的传统治疗手段存在药效差,毒副作用大等缺点,远不能满足临床治疗的需求。因此开发利用新的溃疡性结肠炎的治疗方式势在必行。理想的溃疡性结肠炎的治疗策略应该是精细化和个性化的,具体目标包括:抗炎、抗氧化、黏膜修复以及维持肠道微生物的动态平衡。这要求我们新策略能够将活性药物以合理的方式,合理的时间,合理的量,递送到相应的靶细胞,以实现最大的药效和最小的毒副作用。基于此,依托于成熟纳米技术的纳米药物由于可以进行多体系的融合和多维度的设计,可以为实现这一目标提供强有力的平台支撑。近年来,研究者利用各种材料制备了多种纳米药物载体,如脂质体、聚合物胶束、无机硅纳米颗粒等,并且已经应用于多种疾病的诊断治疗当中。并且随着最近十几年的发展,纳米药物已经进入到精准纳米药物时代。当然相对于合成高分子而言,生物大分子如蛋白质、多糖等,具有良好的生物相容性、生物可降解性以及无免疫原性等特点。因此,它们在药物递送领域受到越来越多的关注。此外天然生物材料所蕴含的特殊性质也值得我们进一步的升入深入研究探索。其中丝素蛋白作为一种来源丰富的天然生物大分子材料,具有分子链柔顺、生物相容性好、可生物降解性、特殊的生物活性和易于加工和化学修饰等特点,具有作为药物递送载体材料的强大潜力。因此,在本研究中我们成功制备了一种基于丝素蛋白的多功能靶向纳米药物(CS-CUR-NPs),并且通过合理的体内外实验评价其对UC的治疗效果。我们利用优化的去溶剂化方法制备各种丝素蛋白纳米药物,然后对其进行表面靶向功能化修饰。通过体外表征我们首次发现了具有二级结构的丝素蛋白纳米药物展现出了优异的多重刺激相应性能。同时通过一系列的体外细胞实验和动物模型实验验证多功能丝素蛋白纳米药物具有优良的抗炎性能和生物安全性能,并且通过口服或者静脉注射给药后,CS-CUR-NPs能程序性聚集到炎症病灶部位,并且被靶细胞特异吞噬,实现抗炎抗氧化和黏膜修复,此外载药丝素蛋白纳米药物能很好的对肠道微生物进行重构,实现对炎症应激的完全逆转,以此达到缓解炎症的效果。本论文的主要研究内容和研究结论分为以下五个部分:第一部分:多功能靶向丝素蛋白纳米药物的制备和表征。蚕茧通过脱胶-溶解-透析-冻干步骤得到再生丝素蛋白材料;通过改进的去溶剂化方法制备载药丝素蛋白纳米药物;利用经典羧基-氨基反应在丝素蛋白纳米粒子表面修饰靶向分子硫酸软骨素(Chondroitin sulfate,CS)。利用动态光散射技术(Dynamic light scattering,DLS)对CS-CUR-NPs的粒径和电位进行表征;利用FESEM观察纳米药物的形貌;利用圆二色谱(CD)、FTIR和XRD对CS-CUR-NPs的二级结构进行分析;利用经典透析方法对CS-CUR-NPs的控释性能进行表征。结果:我们利用去溶剂化方法,并且通过表面功能化修饰,成功将再生丝素蛋白制备成平均粒径为174.5 nm,表面电荷为-35.5 mV的均一球形纳米颗粒。并且在肠胃道模拟液中具有良好的稳定性。此纳米粒子内部形成以β-sheet为优势构象的紧凑结构,活性药物姜黄素(CUR)被包封在内,形成稳定、紧凑的纳米药物。更为重要的是,通过药物控释实验我们首次发现具有β-sheet微晶结构的丝素蛋白纳米药物表现出来优异的多重刺激(pH、ROS和GSH)相应性能。结论:通过改进的去溶剂化方法能成功的制备了具有二级结构的,有着优异理化性质的,并且易于表面功能化修饰的丝素蛋白纳米药物,同时表现出了优异的多重刺激响应性能。第二部分:多功能靶向丝素纳米药物体外细胞实验。利用MTT检测各种丝素蛋白纳米药物对结肠炎相关细胞(结肠上皮细胞CT-26,巨噬细胞Raw264.7)的毒性和生物相容性;分别利用激光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞仪(FCM)定性和定量检测细胞对各种丝素蛋白纳米药物的吞噬情况;利用ELISA方法检测各种纳米药物处理后巨噬细胞炎症因子的分泌情况。结果:通过MTT试验,我们发现基于丝素蛋白的丝素纳米药物表现出了良好的生物相容性,即使丝素蛋白纳米粒子与细胞共孵育48 h也不会出现明显的细胞毒性。通过定性定量的细胞吞噬试验,我们发现CS表面修饰的丝素纳米药物能有效地促进巨噬细胞对其的吞噬,表现出了优异的细胞靶向能力。CS-CUR-NPs处理巨噬细胞后能有效地抑制促炎细胞因子的分泌,同时促进抗炎细胞因子的分泌,并且表现出了时间和剂量依赖性特点,表明CS-CUR-NPs能有效地长时间发挥治疗作用以抵抗炎症疾病。第三部分:多功能靶向丝素纳米药物体内动物模型试验。应用活体/离体成像技术和结合免疫荧光试验,验证将CS-CUR-NPs进行口服或者静脉注射给药后,纳米药物在小鼠结肠病灶部位的程序性聚集和靶细胞的特异性摄取;通过DSS诱导小鼠的UC模型,对各中基于丝素蛋白的纳米药物通过口服和静脉注射给药后,评价不同纳米药物和不同给药方式的疗效差异。结果:通过口服或者静脉注射给药后,CS-CUR-NPs都能有效地聚集到结肠病灶部位,并且能特异的被结肠炎症部位的巨噬细胞吞噬。在UC小鼠模型实验中,总体的结果是静脉注射给药组要好于口服给药组,同时CS靶向修饰纳米药物组要好于未靶向修饰的纳米药物组,其中通过静脉注射CS-CUR-NPs后,表现出了最佳的治疗效果。第四部分:多功能靶向丝素纳米药物对肠道微生物的重构评价。收集UC模型治疗试验中各实验组小鼠的粪便,然后提取菌群总DNA,应用二代测序技术对16S rDNA进行测序和OTU聚类,通过α多样性分析、β多样性分析等手段,对肠道微生物的重构情况进行分析。结果:健康组和UC对照组之间肠道微生物的丰度、多样新和菌群组成存在显著差异。药物干预后形成区别于健康组和UC对照组的独特菌群结构,但总体的规律是:治疗效果越好的组,则肠道微生物的丰度、多样性和菌群结构越接近于健康组,其中静脉注射CS-CUR-NPs治疗组的小鼠肠道菌群最接近健康组。第五部分:多功能靶向丝素纳米药物的生物安全性评价。通过体外血液相容性试验,评价CS-CUR-NPs溶血性能。然后将CS-NPs和CS-CUR-NPs通过口服或静脉注射给药到健康小鼠,通过检测血常规、肝肾毒性和主要器官的组织染色等方面评价丝素纳米药物的生物安全性。结果:CS-CUR-NPs完全无溶血性能,即使浓度达到体内治疗浓度的10倍。此外不管是口服还是静脉注射丝素纳米药物,各试验组小鼠各项指标均正常,与健康组无显著差别。综上所述,基于丝素蛋白的靶向纳米药物显示出了优异的理化性质和多重刺激响应性能,能特异的靶向结肠炎症部位巨噬细胞,实现依赖于炎症的可控药物释放,极大的增强疗效,降低毒副作用。从而为UC疾病的治疗提供了有极大应用潜力的天然刺激响应性药物递送系统。