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背景肠道病毒属于小核糖核酸病毒科,是一种自然界普遍存在的正链RNA病毒。目前发现的肠道病毒已经70余种血清型。肠道病毒属病毒引起的传染病临床主要以轻症为主,表现为低热、乏力、倦怠等症状;少见重症,重症者可全身感染,脑、脊髓、心等重要器官受损,预后较差,会遗留后遗症甚至死亡。近年来由肠道病毒感染引起的传染病波及面广,流行区域已逐渐在欧洲、亚洲以及太平洋地区扩散;流行规模也逐渐由散在发生向聚集性、大面积范围变化,而且发病人群中的重症病例没有明显的规律性。随着该传染病在亚太地区的流行持续不断,中国大陆地区也出现了类似的流行,而且感染人数一直处于明显上升态势。在国内许多公共卫生条件还处于不发达状态的地区,肠道病毒传染病已对健康人群构成了很大的威胁,而目前尚无有效的治疗手段。因此,针对性预防疫苗的研究已成为医药界一项十分迫切的任务。目的为了进行制备肠道病毒疫苗的工艺摸索和初步建立候选毒株,验证现有培养及纯化工艺对于不同肠道病毒生产的适用性,并初步判定所选毒株是否具备作为试验性疫苗生产所要求的高稳定遗传特征。方法将柯萨奇B组2型(CoxB2)、柯萨奇B组6型(CoxB6)、柯萨奇A组7型(CoxA7)、埃可病毒14型(Echol4)四个标准毒株接种于Vero细胞,采用现有生产工艺分别进行培养增殖、病毒收获、PEG10000浓缩、氯仿抽提、碘克沙醇纯化后,吸取病毒纯化条带,制备病毒纯化液。提取RNA、通过RT-PCR技术扩增病毒主要抗原表位VP1片段,测序并将其测序结果分别与各自原始病毒毒株标准序列进行比对,从而分析这四个毒株的遗传稳定性。然后,利用现有工艺进行CoxB6病毒纯化液的灭活,并进一步将制备的实验性灭活疫苗免疫恒河猴幼猴,检测中和抗体效价,初步评价其免疫原性。结果这四种不同的肠道病毒毒株均能够在Vero细胞上适应性生长增殖,在48小时后均能够观察到明显的细胞病变(CPE),继续培养至72小时后可以收获用于浓缩纯化。经15%SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳检测,病毒纯化液纯度较高;经微孔法检测病毒滴度,纯化液中病毒滴度均超过9.5 lgCCID50/ml。纯化液中适应株病毒VP1基因序列和蛋白序列与标准毒株相比,四个不同种类的肠道病毒突变率均接近肠道病毒自然突变平均水平。通过甲醛可使CoxB6病毒完全灭活,实验性CoxB6灭活疫苗能够诱导恒河猴产生中和抗体。结论现有生产纯化工艺适用于不同肠道病毒制备;所选四个毒株在现有生产工艺条件下VP1基因和蛋白序列均未发生显著性变化,遗传性状方面保持了较好的稳定性,同时用现有工艺技术制备的实验性灭活疫苗能够诱导实验动物产生免疫反应,可为下一步的疫苗研发提供参考。