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目的:以fat-1转基因小鼠为实验模型,研究内源性增加n-3多不饱和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids, n-3PUFAs)后,对小胶质细胞以及星形胶质细胞激活的影响,探讨n-3PUFAs对帕金森病模型小鼠病情的影响。
方法:同窝小鼠4周龄时,剪取其尾尖提取DNA进行普通PCR,通过凝胶电泳鉴定基因型后,据此将同时期出生的小鼠分为两组:野生型(WT)小鼠组与fat-1转基因小鼠组,每组各18只雄鼠;饲养四周后,采用腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的方法建立小鼠帕金森病模型。两组帕金森病模型鼠同时进行转棒疲劳仪实验,比较两组模型小鼠在转棒疲劳仪上停留时间的差别,并与相同饲养条件下正常同龄小鼠在疲劳仪上停留的时间比较;颈椎脱臼处死两组模型鼠,取小鼠大脑备用;每组随机选取6个鼠脑做相应处理后,电镜观察两组小鼠大脑纹状体部位突触囊泡数量和突触结构的变化并与相同饲养条件下正常同龄小鼠相同部位做比对;随机选取每组6个鼠脑,冰冻切片,并进行免疫荧光和免疫组化,观察比较两组模型鼠鼠脑冰冻切片大脑纹状体部位星形胶质细胞中间纤维蛋白GFAP的免疫荧光,观察比较两组模型鼠鼠脑冰冻切片大脑海马部位激活的小胶质细胞膜表面蛋白IBA1的免疫荧光及TMEM119的免疫组化;提取剩余鼠脑海马区、纹状体和黑质的蛋白质以及海马区、纹状体总RNA,用提取的蛋白质分别进行GFAP、IBA1的Westernblot实验及TMEM119、TH的ELISA实验,比较两组帕金森模型鼠各相关蛋白含量的差别;将提取的各组总RNA分别进行逆转录,得到GFAP、IBA1、TMEM119三种蛋白的mRNA,并用得到的mRNA进行qPCR,比较两组帕金森模型鼠各组蛋白mRNA表达量的差异。
结果:与野生型小鼠相比,fat-1转基因小鼠在转棒疲劳仪上停留时间明显延长(增加约18%),fat-1转基因小鼠突触囊泡有所增加,TH的ELISA实验结果显示fat-1转基因小鼠酪氨酸羟化酶的水平高于野生型小鼠(P<0.0001);形态学观察,在两组小鼠的免疫荧光与免疫组化中,我们能观察到星形胶质细胞标志蛋白GFAP和小胶质细胞的标志蛋白IBA1、TMEM119的表达以及星形胶质细胞与小胶质细胞的相关形态;相关蛋白进行定量实验后发现,星形胶质细胞标志蛋白GFAP和小胶质细胞的标志蛋白IBA1的Westernblot实验结果以及小胶质细胞的标志蛋白TMEM119的ELISA实验结果均显示:fat-1转基因小鼠这三种蛋白的含量要少于野生型小鼠的蛋白含量(P<0.05,P<0.05,P<0.0001);并且fat-1转基因小鼠星形胶质细胞标志蛋白GFAP以及小胶质细胞标志蛋白IBA1、TMEM119的mRNA表达量明显少于野生型小鼠(P<0.05,P<0.001,P<0.0001)。
结论:fat-1转基因小鼠体内增加的n-3PUFAs,能够改善MPTP诱导的帕金森病模型小鼠部分病征,抑制海马区小胶质细胞和纹状体区星形胶质细胞的激活从而减少对多巴胺能神经元的氧化损伤,保护多巴胺能神经元,这可能是n-3PUFAs改善帕金森病病征的原因之一。
方法:同窝小鼠4周龄时,剪取其尾尖提取DNA进行普通PCR,通过凝胶电泳鉴定基因型后,据此将同时期出生的小鼠分为两组:野生型(WT)小鼠组与fat-1转基因小鼠组,每组各18只雄鼠;饲养四周后,采用腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的方法建立小鼠帕金森病模型。两组帕金森病模型鼠同时进行转棒疲劳仪实验,比较两组模型小鼠在转棒疲劳仪上停留时间的差别,并与相同饲养条件下正常同龄小鼠在疲劳仪上停留的时间比较;颈椎脱臼处死两组模型鼠,取小鼠大脑备用;每组随机选取6个鼠脑做相应处理后,电镜观察两组小鼠大脑纹状体部位突触囊泡数量和突触结构的变化并与相同饲养条件下正常同龄小鼠相同部位做比对;随机选取每组6个鼠脑,冰冻切片,并进行免疫荧光和免疫组化,观察比较两组模型鼠鼠脑冰冻切片大脑纹状体部位星形胶质细胞中间纤维蛋白GFAP的免疫荧光,观察比较两组模型鼠鼠脑冰冻切片大脑海马部位激活的小胶质细胞膜表面蛋白IBA1的免疫荧光及TMEM119的免疫组化;提取剩余鼠脑海马区、纹状体和黑质的蛋白质以及海马区、纹状体总RNA,用提取的蛋白质分别进行GFAP、IBA1的Westernblot实验及TMEM119、TH的ELISA实验,比较两组帕金森模型鼠各相关蛋白含量的差别;将提取的各组总RNA分别进行逆转录,得到GFAP、IBA1、TMEM119三种蛋白的mRNA,并用得到的mRNA进行qPCR,比较两组帕金森模型鼠各组蛋白mRNA表达量的差异。
结果:与野生型小鼠相比,fat-1转基因小鼠在转棒疲劳仪上停留时间明显延长(增加约18%),fat-1转基因小鼠突触囊泡有所增加,TH的ELISA实验结果显示fat-1转基因小鼠酪氨酸羟化酶的水平高于野生型小鼠(P<0.0001);形态学观察,在两组小鼠的免疫荧光与免疫组化中,我们能观察到星形胶质细胞标志蛋白GFAP和小胶质细胞的标志蛋白IBA1、TMEM119的表达以及星形胶质细胞与小胶质细胞的相关形态;相关蛋白进行定量实验后发现,星形胶质细胞标志蛋白GFAP和小胶质细胞的标志蛋白IBA1的Westernblot实验结果以及小胶质细胞的标志蛋白TMEM119的ELISA实验结果均显示:fat-1转基因小鼠这三种蛋白的含量要少于野生型小鼠的蛋白含量(P<0.05,P<0.05,P<0.0001);并且fat-1转基因小鼠星形胶质细胞标志蛋白GFAP以及小胶质细胞标志蛋白IBA1、TMEM119的mRNA表达量明显少于野生型小鼠(P<0.05,P<0.001,P<0.0001)。
结论:fat-1转基因小鼠体内增加的n-3PUFAs,能够改善MPTP诱导的帕金森病模型小鼠部分病征,抑制海马区小胶质细胞和纹状体区星形胶质细胞的激活从而减少对多巴胺能神经元的氧化损伤,保护多巴胺能神经元,这可能是n-3PUFAs改善帕金森病病征的原因之一。