病原体分泌胞外蛋白是逃避宿主先天性免疫反应的重要机制。核酸酶广泛存在于微生物中，主要参与营养代谢、遗传物质的复制、重组和修复机制等过程，且某些细菌分泌的胞外核酸酶有利于病原体感染，是细菌的一类重要毒力因子。5-nucleotidase 是一种特殊的磷酸水解酶，部分病原体通过 5-nucleotidase 合成脱氧腺苷和腺苷以抑制宿主免疫反应，同时 5-nucleotidase 可直接降解胞外诱捕网的 DNA 结构，有助于病原体逃避中性粒细胞的杀伤。虽然基因组分析显示鼠伤寒沙门菌具有 5-nucleotidase 基因，但关于鼠伤寒沙门菌胞外蛋白是否具有核酸酶活性和 5-nucleotidase 基因的研究尚未见报道。因此，本研究首先对鼠伤寒沙门菌胞外蛋白的核酸酶活性进行分析和鉴定，然后以核酸酶基因 5-nucleotidase作为目的基因，通过克隆 5-nucleotidase 基因，对其进行生物信息学分析，构建5-nucleotidase 原核表达系统，并诱导表达纯化获得重组5-nucleotidase 蛋白。同时采用同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌 5-nucleotidase 基因缺失菌株，并分析缺失菌株的生物学特性，为进一步探究 5-nucleotidase 在鼠伤寒沙门菌感染中的作用奠定基础。
　　1. 鼠伤寒沙门菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的鉴定
　　通过琼脂糖凝胶电泳法、琼脂扩散法和琼脂培养法证实了鼠伤寒沙门菌SL1344 株的胞外蛋白具有降解 λDNA 的活性，且具有剂量依赖性，最适温度和pH分别为50℃和8.0。在Ba2+、Mg2+、Fe3+和Mn4+的高离子强度存在下，胞外蛋白的核酸酶活性具有明显的增强，SDS-PAGE 酶谱分析发现鼠伤寒沙门菌胞外分泌蛋白存在四条活性核酸酶条带，采用 LC-ESI/MS/MS 技术进一步鉴定出七种蛋白质。
　　2. 鼠伤寒沙门菌核酸酶基因5-nucleotidase的原核表达及活性分析
　　通过 PCR 扩增得到鼠伤寒沙门菌 5-nucleotidase 基因，利用生物信息学相关软件对其进行预测分析。将目的基因连接至表达载体pET-32a构建重组表达质粒 pET-32a-5-nucleotidase，经大肠杆菌原核表达、纯化，采用 SDS-PAGE 和Western-blot 分析，琼脂糖凝胶电泳分析重组蛋白的核酸酶活性。结果显示，成功克隆了1482 bp 的5-nucleotidase 基因，该基因与肠杆菌属有较高的同源性， IPTG 诱导获得可溶性和包涵体表达的重组 5-nucleotidase 蛋白，Western-blot 结果表明重组蛋白具有良好的反应原性。同时，可溶性表达的重组蛋白可降解λDNA，但核酸酶活性没有DNase I强。
　　3. 鼠伤寒沙门菌核酸酶基因5-nucleotidase缺失菌株的构建
　　利用同源重组方法构建鼠伤寒沙门菌核酸酶基因 5-nucleotidase 缺失菌株，以鼠伤寒沙门菌 SL1344 株为受体菌、大肠杆菌 χ7213（pRE-?5-nucleotidase）为供体菌，进行接合转移，并通过自杀性质粒介导的同源重组进行筛选 5-nucleotidase 基因缺失菌株。PCR 鉴定和测序结果显示，成功构建鼠伤寒沙门菌5-nucleotidase 基因缺失菌株 SL1344?5-nucleotidase。将 5-nucleotidase 基因连接至载体 pBR322 ，转化至 SL1344Δ5-nucleotidase 缺失菌株构建回复菌株SL1344CΔ5-nucleotidase。
　　4. 鼠伤寒沙门菌核酸酶基因5-nucleotidase缺失菌株的生物学特性
　　以亲本菌株 SL1344、缺失菌株 SL1344Δ5-nucleotidase 及回复菌株SL1344CΔ5-nucleotidase 为研究对象，对其表型、生长特性、遗传稳定性、生物被膜形成、对HeLa细胞的粘附和侵入、对小鼠的毒力、免疫小鼠后IgG抗体水平以及对小鼠的免疫保护率、核酸酶活性等生物学特性进行检测。结果显示，缺失菌株 SL1344Δ5-nucleotidase 的表型、生长特性、生物被膜以及侵袭能力等与亲本菌株基本相同，但是毒力明显降低，缺失菌株的 L D50增加至亲本菌株的 5 1倍。缺失菌株免疫小鼠后血清中 IgG 抗体含量明显提高，且对小鼠有 50%的免疫保护率，缺失菌株的核酸酶活性较亲本菌株有所降低。